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糖尿病是一种常见的易发性代谢疾病,其中90%以上为2型糖尿病。胰岛素抵抗是2型糖尿病的主要特征,其本质是胰岛素信号转导通路中的某些环节出现故障。近年来越来越多的证据表明,活性氧和活性氮介导糖尿病及其并发症的病理过程。氧化应激状态下NO衍生得到的ONOO-是一个强氧化剂和硝化剂,可与多种生物大分子反应,引起脂质过氧化、DNA损伤和蛋白质修饰。蛋白质酪氨酸硝化是一种重要的蛋白质翻译后修饰,它与炎症、心血管疾病和神经退行性疾病等多种病症相关,而ONOO-路径是导致体内蛋白质酪氨酸硝化的重要途径。蛋白质酪氨酸硝化能影响蛋白质酪氨酸磷酸化,从而影响酪氨酸磷酸化介导的信号转导通路。研究表明ONOO-与胰岛素抵抗及糖尿病的发生发展密切相关,但ONOO-对胰岛素信号转导通路的调控作用及其机理尚不完全清楚。本论文从体外化学体系、细胞培养实验和体内动物实验三个方面入手,以纯化胰岛素受体、HepG2细胞和原代骨骼肌细胞、2型糖尿病小鼠模型为研究对象,探讨了ONOO-对胰岛素信号转导的调控作用及其机理,所取得的主要结果有:（1）ONOO-对骨骼肌细胞中胰岛素信号分子基因表达的影响以原代培养骨骼肌细胞为研究对象,采用MTT检测和实时定量PCR技术研究了化学合成ONOO-和SIN-1对IR/IRSs/PI3-K/Akt通路和IR/CAP/Cb1通路中信号分子基因表达的影响。结果表明,50-1000μM的ONOO-处理显著减少了骨骼肌细胞中IR、IRS-1、CAP、Cb1和Glut4的基因表达水平,并具有浓度依赖性。而且,SIN-1浓度依赖地减少了骨骼肌细胞中IR、Cb1和Glut4的基因表达水平,对IRS-1、CAP、p85α和SHIP2的基因表达水平则具有双向调节作用,即低浓度下表现为促进作用,高浓度下表现为抑制作用。以上结果表明较高浓度的ONOO-可能下调IR/IRSs/PI3-K/Akt通路和IR/CAP/Cb1通路中信号分子的基因表达水平,从而抑制骨骼肌细胞中的胰岛素信号转导。（2）ONOO-对HepG2细胞中胰岛素磷酸化信号的影响以HepG2细胞为研究对象,采用亚细胞分级和Western Blotting技术,研究了ONOO-引起的蛋白质酪氨酸硝化对胰岛素刺激的酪氨酸磷酸化信号的影响,以及硝化蛋白和磷酸化蛋白的亚细胞定位。结果表明ONOO-浓度依赖性地引起了HepG2细胞蛋白质的硝化,硝化蛋白主要位于细胞膜和细胞核上。ONOO-在低浓度下（10-50μM）促进膜蛋白和胞质蛋白的酪氨酸磷酸化,可能起到信号分子的作用;在高浓度下（100-200μM）抑制膜蛋白和胞质蛋白的磷酸化,可能与胰岛素抵抗的发生有关,提示ONOO-对胰岛素信号转导通路可能具有双向调节作用。（3） ONOO-对胰岛素受体自磷酸化和激酶活性的影响采用免疫沉淀、免疫印迹、放射配体结合实验、小鼠血糖测定和实时定量PCR等方法研究了ONOO-在体外和体内对胰岛素受体自磷酸化和激酶活性的影响。体外实验结果表明,无论在基础状态下还是在胰岛素刺激状态下,低浓度的ONOO-（50μM）促进了胰岛素受体的自磷酸化和激酶活性,可能作为一个信号分子,而高浓度的ONOO-（100-500μM）抑制了胰岛素受体的自磷酸化和激酶活性,可能介导胰岛素抵抗的发生。ONOO-的这种双向调节作用可能与它对胰岛素受体的硝化和氧化修饰有关。此外,酪氨酸磷酸酯酶活性的降低以及胰岛素受体与125I-胰岛素结合能力的降低也参与了这一调节过程。进一步的体内研究表明,腹腔注射0.1mg/kg和0.25mg/kgSIN-1显著降低了正常小鼠的血糖,其作用机理与IR/IRS-1酪氨酸磷酸化水平升高有关。腹腔注射0.25mg/kg和0.5mg/kg SIN-1显著升高了糖尿病小鼠的血糖,其作用机理与IR/IRS-1酪氨酸磷酸化水平降低有关。以上研究结果首次阐明了ONOO-在体外和体内如何影响胰岛素受体功能,提示ONOO-对胰岛素受体的自磷酸化和激酶活性具有双向调节作用。（4）ONOO-在小鼠骨骼肌胰岛素抵抗发生中的作用采用胰岛素耐量测试、免疫沉淀和免疫印迹等方法研究了SIN-1对正常小鼠胰岛素敏感性的影响,以及骨骼肌中IR、IRS-1和Akt的硝化和磷酸化。采用高脂饮食诱导胰岛素抵抗小鼠模型,检测骨骼肌中IR和IRS-1的硝化和磷酸化,并观察了ONOO-清除剂FeTPPS对上述效应的干预作用。研究结果表明,正常小鼠腹腔注射10mg/kg SIN-1后,与空白对照组相比胰岛素敏感性显著降低,骨骼肌中IR、IRS-1和Akt的硝化水平显著增加,而且在胰岛素刺激状态下IR、IRS-1和Akt的磷酸化水平显著降低,这可能是SIN-1导致胰岛素敏感性降低的重要原因。此外,SIN-1慢性注射使IRS-1蛋白质表达水平显著降低。在高脂饮食诱导的胰岛素抵抗小鼠中,与正常对照组相比骨骼肌中IR和IRS-1硝化水平显著升高,磷酸化水平显著降低,胰岛素敏感性也显著降低。使用FeTPPS治疗后,与高脂饮食组相比骨骼肌中IR和IRS-1硝化水平显著降低,磷酸化水平显著升高,胰岛素敏感性也显著升高。以上研究结果提示IR、IRS-1和Akt的硝化是iNOS介导的胰岛素抵抗的一种新的机理。（5）糖尿病小鼠肝脏和骨骼肌中硝化蛋白质组的初步研究采用免疫沉淀结合SDS-PAGE分离、免疫印迹、胶内酶切和LC-ESI-MS/MS等方法鉴定了体外硝化BSA的硝化位点,并探讨了2型糖尿病小鼠肝脏和骨骼肌中的蛋白质硝化。研究结果表明,BSA发生硝化的酪氨酸为Tyr161和Tyr424。与正常小鼠相比,糖尿病小鼠肝脏和骨骼肌中蛋白质硝化水平显著升高,肌浆/内质网Ca2+-ATP酶是骨骼肌中主要的硝化蛋白之一。