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目的： 脆性X综合征(Fragile X syndrome,FXS)是一种常见的X染色体连锁的遗传病,临床特点主要为智力发育异常、过度活跃及易伴发癫痫等神经元网络的过度兴奋表现.课题组前期研究显示FXS动物模型Fmr1敲除小鼠的神经元细胞膜兴奋性异常,动作电位发放频率增加.A型钾离子通道是神经元兴奋性调节重要因子,可能与脆性X综合征的发病机制有关.Kv1.1是A型钾离子通道的关键组成成分,作为Shaker钾离子通道亚族的一员,Kv1.1在神经元兴奋性的调节中发挥着不可或缺的作用,它的功能异常已被证明与多种神经系统疾病相关.据此推测：在FMRP缺失的情况下,Kv1.1的蛋白表达发生异常,影响细胞Kv1.1介导的钾电流,导致神经元兴奋性的改变,可能是FXS的重要致病机制.本研究利用Fmr1敲除FVB小鼠(KO)作为FXS的动物模型,选取三个年龄点,包括出生后10天(P10),30天(P30)和60天(P60),研究不同发育阶段Kv1.1蛋白表达及分布变化,随后运用膜片钳技术和Kv1.1特异性抑制剂树眼睛蛇毒素-κ(dendrotoxin-κ,DTX-κ),研究Kv1.1介导的特异性电流,及其电生理动力学特性的改变,探讨Kv1.1通道功能异常与脆性X综合征小鼠神经元兴奋性的关系. 方法： 1.PCR扩增法鉴定Fmr1KO小鼠基因型. 2.随机抽取3个年龄组的WT和Fmr1KO小鼠,包括P10,P30,和P60,分别代表幼年,青年,成年三个主要发育阶段. 3.分离海马组织,抽取蛋白,利用免疫印迹法检测不同年龄组WT及Fmr1KO鼠海马Kv1.1蛋白表达水平. 4.对海马切片进行免疫组织化学分析,观察Kv1.1的表达改变和分布特征. 5.制作急性脑片,利用全细胞膜片钳技术,通过选择性阻断剂DTX-κ分离Kv1.1特异的电流,研究Fmr1KO和WT海马锥体神经元Kv1.1通道功能的差异和神经元动作电位发放. 结果： 1、Western bloting和免疫组织化学均显示在WT和Fmr1KO小鼠中Kv1.1的表达呈发育性递增.比较相同发育阶段的Fmr1KO和WT小鼠海马,可以发现P10和P60组,Fmr1KO小鼠海马Kv1.1蛋白水平比WT显著降低,下降幅度大于50%,差异有统计学意义(p<0.01),但在P30组未见显著差异.免疫组织化学显示Kv1.1在海马辐射层和海马始层及CA3区高表达.比较Fmr1KO和WT小鼠的Kv1.1的表达和分布情况,可见Fmr1KO小鼠海马结构Kv1.1的表达显著减少,在CA3区尤为显著. 2、利用全细胞膜片钳技术,记录P10龄小鼠的急性脑片的海马CA3区神经元的电压依赖型钾电流. 结果：发现Fmr1KO组的CA3区锥体神经元的钾电流显著低于WT组(P<0.05).用系列浓度的Kv1.1特异性抑制剂DTX-κ灌流脑片后,发现在Fmr1KO神经元组的DTX-κ对全细胞钾电流的有效半数抑制浓度(IC50)为1.65nM,低于WT组(IC50=3.03nM);通过拟合方程计算结果显示KO组钾电流的下降等效于2.49nM DTX-κ处理WT组.进一步利用100nM DTX-κ完全阻断Kv1.1通道,分离Kv1.1介导的钾电流,结果显示Fmr1KO小鼠中Kv1.1介导的特异性钾电流密度显著下降,半数激活电压增高,电压依赖失活特性无显著改变,失活后复活时间显著缩短. 3、利用电流钳方法比较诱发动作电位的频率,结果显示相同大小的去极化电流在Fmr1KO小鼠神经元可诱发动作电位数量显著增加(p<0.01);而等效剂量的DTX-κ(2.49nM)处理WT组细胞,同样可显著增加动作电位的发放,诱发动作电位的数量上与Fmr1KO小鼠神经元细胞相似,提示Fmr1KO组神经元动作电位发放频率的增加可能与Kv1.1的减少有关. 结论： 1、Kv1.1在大脑海马的表达水平呈发育性递增,Fmr1敲除小鼠在出生后10天和成年期Kv1.1表达不足. 2、Fmr1KO神经元钾电流密度显著低于WT神经元,其中的电流成分包括Kv1.1介导的电流.Fmr1KO神经元的Kv1.1电流密度下降可能与Kv1.1表达不足有关.Fmr1KO神经元的Kv1.1特异性电流发生通道动力学的改变,主要表现为激活电压去极化偏移,失活后的复活时间缩短. 3、Kv1.1特异性电流的减少可导致WT神经元动作电位发放频率的增加,提示Fmr1KO神经元的兴奋性增高与细胞膜Kv1.1的表达和功能改变有关.