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自身免疫性疾病的发生和进展中出现的比较早的炎症性因子主要是IL-17,可以促进相对而言比较多的趋化因子的产生。单核细胞趋化因子-1(monocyte chemoattractant protein,MCP-1)是与炎症的发生存在着密切关系的一种因子,在病毒性心肌炎(viral myocarditis,VMC)心肌组织中单个核细胞的浸润中发挥着重要的作用。在我们以往的研究中发现MCP-1可以通过其受体CCR2介导VMC心肌损伤,并且IL-17能够通过上调MCP-1的表达加重心肌细胞的损伤。然而IL-17上调心肌细胞MCP-1的表达机制目前还不是非常明确,通过阐明其发生机制,减少MCP-1的表达这将对缓解VMC的发生发展很有意义。启动子是在转录途径被激活后发挥着动员作用的DNA序列,与转录因子结合后在调节基因的转录方面有着举足轻重的地位。转录因子AP-1(Activator protein-1)是与炎症反应的发生过程中有着亲密关系的重要的一个核转录因子,一般是存在于基因的启动子上面的,在多种信号转导通路中发挥重要作用,近几年的研究备受关注。研究发现,IL-17可以与存在与不同细胞表面的受体IL-17R结合来激活AP-1,同时在一些细胞中激活的AP-1能够上调MCP-1的表达。但是在IL-17上调心肌细胞中MCP-1的表达是否涉及AP-1的激活,目前还不非常明白。IL-17与IL-17RA结合后可能触发下游的信号转导通路IL-17R-Act1-TRAF6,并且有研究发现在一些细胞中IL-17可以通过MAPK信号转导通路介导AP-1的活化从而刺激MCP-1的表达,但是,IL-17通过何种信号转导通路上调MCP-1的表达,目前其机制还不是非常明白。我们通过软件预测发现多种转录因子的结合位点存在于MCP-1的启动子上,如AP-1、NF-κB、SP-1等结合位点。鉴于此,我们推测IL-17与IL-17R结合后可能通过Act1/TRAF6/MAPK信号通路激活转录因子AP-1进而上调心肌细胞MCP-1的表达,从而介导VMC的进展,这对于病毒性心肌炎的发病机制的研究很有意义,也将为病毒性心肌炎的诊疗提供一个新的靶点。目的研究IL-17能否通过Act1/TRAF6/MAPK信号转导通路激活转录因子AP-1进而上调心肌细胞MCP-1表达。方法1.BALB/c小鼠的心肌细胞采用差速贴壁的方法进行分离,并对心肌细胞进行原代培养。2.设计含有心肌细胞MCP-1启动子的目的基因的特定引物,然后将启动序列与荧光素酶报告基因载体pGL3-basic结合,构建荧光素酶报告基因载体pGL3-MCP-1-Luc。3.双荧光素酶报告基因系统检测不同浓度的IL-17以及KCTD1、Act1siRNA、TRAF6 inhibitor、LY294002、SB203580通路分子抑制作用下pGL3-MCP-1-Luc荧光素酶的相对活性。4.Western blot检测IL-17作用不同时间下Act1、TRAF6、MAPK和c-jun磷酸化的表达情况。5.Western blot以及ELISA检测信号转导通路蛋白的小分子抑制剂或siRNA作用后,心肌细胞MCP-1以及AP-1小分子c-jun磷酸化的表达。6.SPSS17.0软件建立数据库对结果分析。组间的对比采用单因素方差进行分析,实验组之间的对比采用单因素方差分析中的LSD-t检验进行两两比较,检验水准为α=0.05。结果1.荧光素酶报告基因载体pGL3-MCP-1-Luc的鉴定。经酶切电泳及测序确定载体构建成功;同时荧光素酶报告基因系统检测IL-17作用下pGL3-MCP-1-Luc荧光素酶的相对活性,结果显示:不同浓度(0、5、10、50、100ng/ml)的IL-17刺激报告基因载体pGL3-MCP-1-Luc,每组均与未加入IL-17的心肌细胞相比,荧光活性增加(P<0.01),且随着IL-17浓度的增加,荧光素酶的活性随之增加。2.IL-17作用下心肌细胞发生改变的信号通路筛选。IL-17+Act1 siRNA组、IL-17+TRAF6 inhibitor组和IL-17+SB203580组与IL-17对照组相比,荧光活性明显降低(P<0.05);加入IL-17+KCTD1组和IL-17+LY294002组与IL-17组相比,荧光活性没有明显变化(P>0.05)。3.IL-17作用下心肌细胞Act1、TRAF6、p-p38和p-c-jun表达分析。IL-17作用于心肌细胞5min、15min和30min的结果表明,Act1、TRAF6、p-p38和p-c-jun含量随着时间的延长呈增加状态,与未加入IL-17前相比具有统计学意义(P<0.05)。4.Act1/TRAF6/p38MAPK和AP-1的在IL-17上调心肌细胞MCP-1表达中的作用。IL-17+Act1siRNA组与IL-17+Act1 control组相比,MCP-1的含量明显减少(P<0.05),同时与IL-17对照组相比MCP-1含量也明显减少(P<0.05);IL-17+TRAF6 inhibitor组与IL-17+TRAF6 control组相比的MCP-1含量明显减少(P<0.05),同时与IL-17对照组相比也减少(P<0.05);IL-17+SB203580组的MCP-1含量低于IL-17+p38 control组相比(P<0.05),且低于IL-17对照组(P<0.05)。在研究AP-1作用下,结果显示:加入IL-17组的MCP-1含量高于对照组,且高于IL-17+Curcumin组(P<0.05)。5.IL-17在上调心肌细胞MCP-1表达中Act1/TRAF6/p38MAPK和c-jun磷酸化的作用关系:与阴性对照组相比,IL-17组的p-c-jun表达明显增加;而IL-17+Act1 siRNA组的p-c-jun表达低于IL-17+negative siRNA组;IL-17+TRAF6inhibitor组、IL-17+SB203580组的p-c-jun含量低于IL-17组(P<0.05)。结论1.IL-17可以通过c-jun的磷酸化上调心肌细胞MCP-1的表达。2.IL-17可以通过Act1/TRAF6/p38MAPK信号转导通路上调心肌细胞MCP-1的表达。3.IL-17通过Act1/TRAF6/MAPK信号转导通路激活AP-1的表达上调心肌细胞MCP-1的表达。