志贺菌(shigella spp.)为革兰氏阴性菌,是引起细菌性痢疾的重要病原菌,主要通过粪口途径传播,侵袭并定植结肠上皮细胞而引起典型细菌性痢疾的症状,如里急后重、发热、腹痛、腹泻、休克等等。志贺菌根据抗原的结构和生化反应的不同主要分为4群,其中福氏志贺菌是发展中国家的主要流行菌株,以2a血清型为主。据世界卫生组织报道,全球每年感染细菌性痢疾的患者可达到1.6亿,其中死亡病例约110万,且2/3的感染者多为5岁以下的儿童。由于志贺菌的感染剂量极低(10-100个细菌),以及致病机理和宿主的免疫保护机制尚不完全清楚,所以细菌性痢疾的暴发流行严重危害了人类的健康,因此对福氏志贺菌的致病机制研究对我国细菌性痢疾的预防和治疗具有重要意义。原核生物和真核生物中除了三种经典的RNA,如t RNA,r RNA,和m RNA外,还存在着一类新型的具有重要调控功能的RNA,非编码RNA(nc RNA),在细菌中被统称为small RNA(s RNA),大小在50-500nt之间,主要作用方式是通过碱基互补配对与靶标基因m RNA的5’UTR结合,进而影响m RNA的稳定性和翻译从而在转录水平上调控基因表达。有研究报道,细菌中的s RNA执行着多种重要的生物学功能,如生长代谢,毒力调控,适应环境压力等等。原核生物中s RNA的研究主要集中于大肠杆菌,已有近百种s RNA被发现,其功能也不断被阐明。例如,在大肠杆菌中Mic F是长度为93nt的s RNA,它可以与omp F m RNA配对来抑制外膜蛋白omp F的表达[1];Oxys可以与编码转录激活子fhl A结合进而抑制其翻译[2],而目前福氏志贺菌的全基因组测序工作已完成,但还没有针对福氏志贺菌系统地开展s RNA的识别和功能研究工作,因此开展福氏志贺菌s RNA的研究,并发现具有重要功能的s RNA,将加深对细菌致病机理等方面的理解,同时也对药物研究和疫苗开发提供新的思路。首先,通过生物信息学的方法在福氏志贺菌中预测s RNA候选基因,根据s RNA高度保守性的特点,利用生物信息学的转录单元预测方法,通过寻找基因间区的启动子或是终止子来预测新的s RNA,最后成功地在福氏志贺菌2a 301株中预测得到了57条候选s RNA。然后对生物信息学预测到的s RNA进行验证,RT-PCR和Northern blot实验最后确定新发现4条s RNA,分别命名为Ssr1、Ssr9、Ssr44和Ssr54。通过RACE实验进一步确定了这4条s RNA的转录起始和终止位点,并获得它们的全长序列信息。为研究新发现的s RNA在福氏志贺菌所发挥的生物学功能,采用λ-RED同源重组的方法成功地构建了Ssr1和Ssr54的2条s RNA的突变株。首先,研究s RNA对福氏志贺菌在不同环境压力下生长状态的影响,将野生株、Ssr1和Ssr54突变株及其回复株置于不同环境压力培养基中培养24h并绘制生长曲线,结果发现,Ssr1缺失后在p H5.0的酸性压力下生长速度与野生株相比较为缓慢,Ssr54缺失后在高渗透压环境压力下生长速度与野生株相比明显加快。为研究s RNA在福氏志贺菌响应不同环境压力方面的功能,利用q RT-PCR方法检测Ssr1和Ssr54在不同环境压力下表达水平的差异,结果发现,Ssr1的表达水平在p H 2.0、p H 2.5、p H 3.0、p H 3.5和p H 4.0的酸性环境中相对于p H 7.0显著升高,并且随着p H值的升高Ssr1的表达逐渐降低,Ssr54在p H5.5、p H 6.0、p H 6.5、低渗透压、营养缺乏和氧化应激环境压力下的表达水平均有明显升高,说明Ssr1和Ssr54通过响应不同环境压力信号中来发挥生物学功能。对比野生株与Ssr1和Ssr54突变株在不同环境压力刺激一定时间后的生存率,实验发现Ssr1缺失后在酸性培养条件下生存率下降了22%,Ssr54缺失后在氧化应激压力下生存率升高了30%,说明Ssr1和Ssr54在影响了福氏志贺菌耐受环境压力的能力。通过以上研究发现,Ssr1和Ssr54通过响应外界环境压力信号,进而改变自身的表达量,从而增强适应环境的能力。为了研究Ssr1和Ssr54是否在福氏志贺菌的致病方面发挥的功能,开展了豚鼠角膜结膜炎实验和小鼠肺竞争性侵袭等毒力实验,结果表明,Ssr1缺失后导致豚鼠角膜结膜炎症反应增强,小鼠肺侵袭能力增强,这说明Ssr1的缺失使福氏志贺菌的毒力增强;而Ssr54缺失后豚鼠角膜结膜炎症反应减弱,小鼠肺侵袭能力下降,说明Ssr54的缺失使福氏志贺菌的毒力减弱,以上结果说明Ssr1和Ssr54均参与了福氏志贺菌毒力功能的调控。为了进一步探索Ssr1和Ssr54在机体免疫应答中的功能,对野生株和两条s RNA突变株感染过程中宿主产生的细胞因子进行检测分析,包括TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ。结果显示Ssr1突变株感染小鼠24h后,与野生株相比,IL-1β的表达显著升高;感染48h后,与野生株相比,TNF-α的表达显著升高,说明Ssr1突变株感染早期Ssr1突变株可诱导TNF-α和IL-1β表达水平升高,使炎症反应增强,与豚鼠角膜结膜炎的结果一致。Ssr54突变株感染小鼠后,与野生株细胞因子表达水平与野生株相比无明显差异。为了深入研究Ssr1和Ssr54发挥生物学功能的具体作用机制,进一步利用双向电泳寻找Ssr1和Ssr54潜在的靶标。经质谱分析Ssr1缺失共有51个蛋白差异点,其中27个下调蛋白,24个上调蛋白;Ssr54缺失共发现40个差异蛋白,其中25个下调蛋白,15个上调蛋白。对Ssr1和Ssr54缺失后表现出明显差异且具有重要意义的蛋白进行了q RT-PCR验证,即在转录水平上验证相应蛋白编码基因表达量的相应变化,包括Ssr1缺失后dnak,ipa A,mxi C,ipg C和ipa D的表达,以及Ssr54缺失后tol C,hns,tre F和omp A的表达,结果与双向电泳结果一致。福氏志贺菌Ssr1通过响应酸性环境压力信号,可能通过上调dnak的表达基因来提高福氏志贺菌耐受酸性环境压力影压力信号,上调dna K基因的表达提高耐受酸性环境压力的功能的能力,并通过下调影响T3SS中的ipa A,mxi C,ipg C和ipa D基因的表达来降低引起福氏志贺菌的毒力功能的降低;Ssr54可能通过响应渗透压等环境压力信号,下调tre F降低耐受高渗压力能力,并通过上调tol C和hns基因的表达来提高福氏志贺菌的毒力功能。s RNA发挥功能的机制可能是直接与靶标m RNA结合,或者间接调节靶标m RNA的表达,大多数s RNA需要Hfq蛋白的结合来调控靶标基因的表达进而发挥一定的生物学功能,为了揭示我们新发现的s RNA是否依赖Hfq来发挥功能,首先开展福氏志贺菌中Hfq的具体功能的研究。细菌中的Hfq蛋白(host factor for RNA phage Qβ)是一类高度保守的RNA结合蛋白,主要的生物学功能是通过结合并帮助s RNA与靶标m RNA结合来影响靶标基因的表达。已有研究表明Hfq在细菌中发挥多种生物学功能,包括环境压力适应、耐受环境压力、毒力等等。但是Hfq的大小在不同细菌中有所不同,如在大肠埃希菌中Hfq蛋白为102aa氨基酸,而在金黄色葡萄菌中为77aa氨基酸,不同细菌中Hfq发挥的功能和作用机制也不同,如铜绿假单胞菌、布鲁氏杆菌中Hfq蛋白影响外毒素表达[3,4],大肠杆菌中Hfq还有ATP酶的活性,从而加速转录及翻译过程[5]。因此深入研究福氏志贺菌中Hfq的功能及调控机制,将有助于对福氏志贺菌s RNA致病机制的深入研究。首先利用λ-RED同源重组的方法成功地构建了福氏志贺菌的hfq突变株。将hfq克隆到p ACU184低拷贝质粒中再转入hfq突变株的方法构建了hfq回复株,并通过PCR的方法验证证明构建成功。hfq突变株和回复株的构建为福氏志贺菌中hfq的功能研究奠定了基础。hfq的缺失对福氏志贺菌生存及生长状态影响做了生长曲线分析,结果显示,与野生株相比,hfq突变株在正常条件下进入平台期后生长速度明显下降,在酸性环境压力下生长速度在对数生长期较野生株明显减慢。为研究hfq对福氏志贺菌不同环境压力下生存能力的影响,我们进行了野生株和hfq突变株在不同生存环境压力的生存率实验,在高渗透压、酸性及氧化应激刺激下,hfq突变株的生存率均较野生株有明显的降低,降低的幅度在30%-60%之间,说明hfq在福氏志贺菌耐受环境压力中发挥着至关重要的作用。为了研究hfq能否有效地响应环境压力,利用q RT-PCR检测了hfq在福氏志贺菌应对不同环境压力下的表达情况,结果发现hfq在酸性和氧化应激压力下表达水平显著升高,同时发现在不同p H环境下耐酸相关基因(gad B,gad A,hde B,hde A和hde D)及毒力相关基因(ipa A,ipa B,ipa J,ipa H4.5,ipa H9.8,ipa H1.4,ipa H7.8,ipa H2.5,ipg D,ipg H,mxi C,mxi I,mxi M,spa13,spa15,spa33,spa P和spa9)的表达与hfq的表达具有显著正相关性,并且均在p H2.0-4.0的环境压力下表达水平最高,说明hfq能够有效地响应酸性和氧化应激压力信号。小鼠肺侵袭和He La细胞侵袭等毒力实验的结果表明,hfq缺失后福氏志贺菌的侵袭力明显下降,说明hfq对福氏志贺菌的毒力功能有一定影响。检测野生株和hfq突变株感染小鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ细胞因子产生的水平变化,结果发现感染24h后,hfq突变株感染的肺泡灌洗液中TNF-α表达与野生株相比明显降低,炎症反应减弱,与豚鼠角膜结膜炎表现的结果一致,说明hfq缺失后影响了福氏志贺菌引起的机体免疫应答的改变,细胞因子分泌下降炎症反应减弱。为研究hfq发挥适应环境压力和毒力方面的作用机制,利用q RT-PCR检测了T3SS相关基因和耐酸相关基因在hfq突变株和野生株中的表达情况,结果发现hfq突变株中T3SS相关基因基本不表达,耐酸相关基因的表达与野生株相比也明显降低。以上结果说明,hfq通过响应酸环境压力信号,上调耐酸相关基因来提高福氏志贺菌耐受酸环境压力能力,上调T3SS相关基因来影响福氏志贺菌的毒力输出的提高。本研究中新发现的Ssr1和Ssr54均参与福氏志贺菌适应环境压力和毒力的调控过程,在hfq相关研究中也发现了类似的功能调控,特别是Ss1和hfq均参与了T3SS的调控,目前,我们正在开展相关实验来验证Ssr1是否与Hfq蛋白结合来发挥生物学功能。此外,我们首次报道了我国新出现的福氏志贺氏菌1c亚型,并对其进行了多位点序列分型分析和耐药性研究,同时首次发现我国的1c型福氏志贺菌对喹诺酮和头孢类抗生素耐药性。综上所述,本研究结合生物信息学和实验验证的方法在福氏志贺菌中新发现了4条s RNA。对福氏志贺菌新发现两条s RNA和Hfq功能研究中发现,它们通过响应不同环境压力的变化,调节相应压力基因,影响毒力基因的表达,进而表现为毒力输出的改变。Hfq是否与我们新发现这两条s RNA结合来共同发挥功能是我们下一步重点开展的研究。这些发现将有助于加深对志贺菌致病性的了解认识,为抗志贺菌感染提供新的分子靶标,也为阐明志贺菌感染的致病机制的研究提供参考和借鉴。