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1.研究背景及课题来源卵巢早衰(premature ovarian failure, POF)是指女性在40岁之前出现卵巢内分泌功能衰竭,表现为超过4个月以上无月经来潮、雌激素缺乏、促性腺激素水平升高(FSH>40IU/ML)的综合征,是导致女性不孕症的原因之一；它可以发生在青春期前、青春期或生育年龄期间。大部分POF病因不明,称为特发性POF,患者无明确诱因,染色体核型正常,自身免疫抗体检测正常,约占POF的80%。POF可表现为原发性闭经(primary amenorrhea,PA)或继发性闭经(secondary amenorrhea,SA),在继发闭经的妇女中,POF约占4%-18%。近年来卵巢早衰在育龄妇女中的发病率有逐年升高且向低龄化发展的趋势,可见该疾病严重影响妇女的生殖健康。据统计,POF在40岁前的人群中发病率约为1%,30岁前约为0.1%,20岁前约为0.01%。卵巢早衰是一种异质性疾病,其病因繁杂,包括遗传性因素、自身免疫性因素、代谢障碍、感染、医源性因素及外界环境因素等,但大多数病例病因不清,属特发性POF。有研究报道,遗传性因素占POF发病病因的近40%,但Jiao X等学者对一份大样本POF染色体核型分析发现,染色体数目或结构异常率仅为12.1%,提示遗传性致病因素更多发生在单基因或核苷酸分子水平。目前少数病例已发现明确的遗传学病因,包括FMR1[5]、FSHR[6]、POFB1[7]、FOXL2[8]、TGFBR3[9,10]、FOXE1[11]及BMP15[12,13],上述基因突变导致蛋白功能异常已被证实。随着分子生物学技术的迅猛发展及人类基因组计划的进展,寻找新的POF易感基因并从基因水平阐明其发病机制已成为对该疾病的研究热点。POF的病理生理特点是先天性卵子数量减少,正常卵泡闭锁过程加速或出生后卵子被不同机制破坏导致卵泡过早耗竭。卵泡的发生和发育不仅受下丘脑-垂体-卵巢轴调控,与卵泡刺激素(FSH)密切相关,还受卵巢内一些自分泌和旁分泌激素的影响。近年来卵巢局部微调节在卵泡生长发育中的作用越来越受到关注,它们共同调节卵泡由始基、初级、次级卵泡至成熟优势卵泡这个有序连续过程。卵巢内合成的局部调节因子包括胰岛素生长因子(IGF)系统,转化生长因子(TGF-β)超家族的成员如颗粒细胞来源的抗苗勒激素(AMH),颗粒细胞和卵泡膜细胞来源的激活素和抑制素,卵母细胞来源的生长分化因子-9和骨形态蛋白等。抗苗勒管激素(Anti miillerian hormone; AMH)作为人类生殖系统发育和功能的相关的一种重要分子,在女性生殖功能活动中起重要作用,AMH异常可导致内在的卵泡生长发育异常及卵巢颗粒细胞分泌异常。研究发现,卵巢中AMH是目前发现的唯一抑制始基卵泡的生长因子,表明AMH与卵泡发育有很强的相关性。已有研究证实AMH由窦前卵泡和小窦卵泡的颗粒细胞分泌,抑制卵泡的生长,防止卵泡过快过早的耗尽,因此,有必要对AMH基因突变与POF发生进行深入研究。AMH通过与受体结合发挥作用。AMH和其他TGF-β家族成员相似,其受体都是由Ⅰ型、Ⅱ型两种组成,此类受体是跨膜丝氨酸-苏氨酸激酶受体,在苗勒氏管周围间质细胞和两性性腺中均有表达。目前已明确AMH与抗苗勒激素Ⅱ型受体(Anti miillerian hormone receptor Ⅱ; AMHR-Ⅱ)具有高度亲和力,并且主要通过位于靶器细胞膜上的AMHR-Ⅱ发挥作用,AMHR-Ⅱ在卵巢主要表达于颗粒细胞和卵泡膜细胞。性腺细胞中,AMH与高度特异性的Ⅱ型受体结合并通过一个或多个BMP-Ⅰ型受体激活BMP特异性Smad1信号通路[15]。鉴于AMHR-Ⅱ在AMH信号通路中的重要作用,提示其可能是POF的候选基因。本研究通过对POF患者AMH, AMHR-Ⅱ进行筛查鉴定,分析其SNPs位点与POF的关联,探讨AMH及AMHR-Ⅱ基因对POF的预测价值,制定出适合中国人群的筛查策略,对早期发现POF倾向和预测生育能力的潜能具有重要的临床意义。2.目的及意义本研究探讨AMH、AMHR-Ⅱ基因多态性与中国汉族特发性卵巢早衰的相关性,寻找POF的致病基因,以期为POF的预防及治疗提供理论基础。3.方法研究资料：选取2012年5月至2013年10月底在南方医科大学附属深圳妇幼保健院妇产科确诊的POF妇女中筛选出120例特发性POF作为病例组。病例组需符合以下标准：(1)年龄在小于40岁,超过4个以上无月经来潮；(2)至少两次测量空腹血清FSH>40IU/L(间隔1个月以上)；(3)超声检查内生殖器呈萎缩状态；(4)排除具有染色体核型异常、免疫因素、感染、手术损伤、放化疗等明显致病因素的患者。对照组选择同期就诊的120例月经规则、性激素六项检查正常、B超示卵巢大小形态正常、年龄相匹配的女性。研究方法：(1)利用饱和酚/氯仿法提取外周血白细胞中的DNA,分别设计AMH基因5个外显子共4个DNA片段及AHMR2基因1个启动子和11个外显子共9个DNA片段的引物,通过对PCR反应产物直接测序后进行序列分析。(2)运用生物软件Clustal W2、Polyphen、SIFT和PMUT程序分别对AMH和AMHR-Ⅱ基因新发现的错义突变进行保守性分析和预测对所编码蛋白质功能造成的影响。(3)运用卡方检验对AMH、AMHR-Ⅱ基因型频率及等位基因型频率在特发性POF病例组与对照组中的分布进行统计学分析,对基因型频率有统计学意义(p<0.05)的SNPs使用二分类Logistic回归分析,以判断其是否为特发性POF的发病危险因素,探讨AMH、AMHR-Ⅱ基因突变致POF的遗传学机制。4.结果(1) AMH、AMHR-Ⅱ基因测序结果分析总共检测了AMH基因5个外显子中的4个DNA片段,AMHR-Ⅱ基因1个启动子及11个外显子中的9个DNA片段,共发现了17个SNP,均为二等位基因型。其中转换1个(A/T),颠换15个(5个A/G,4个T/C,5个T/G,1个A/C),单碱基缺失1个。15个为新发现的突变位点,2个在NCBI的SNP数据库中已见报道。(2) AMHR-Ⅱ基因外显子新发现错义突变分析在AMHR-Ⅱ基因外显子新发现2个错义突变；c.6271>A(p.I209N)和c.1060>T(p.L354F),且只出现在POF组中,在正常对照组中未发现。①用Clustal W2软件对氨基酸进化保守性分析,结果显示AMHR-Ⅱ基因编码的第209位异亮氨酸和第354位亮氨酸在生物进化过程中处于高度保守状态。②用Polyphen, SIFT及PMUT3种程序预测点突变对蛋白质功能造成的影响。p.I209N, Polyphen预测为possibly damaging, SIFT预测为intolerant, PMUT预测为pathological,可靠性指数为2,这些预测结果均提示AMHR-Ⅱ基因1209N可能是影响其编码蛋白质功能的突变。p.L354F, Polyphen预测为possibly damaging,但SIFT预测为tolerant,因此我们应用PMUT程序,PMUT预测为neutral,可靠性指数为8,结果示AMHR-Ⅱ基因L354F可能不对AMHR-Ⅱ蛋白质功能造成影响。(3) AMH、AMHR-Ⅱ基因型在特发性POF患者和对照组中的分布对AMH基因中所发现的3个POF组及对照组均出现的SNP(其中2个为新发现的SNP)进行统计学分析,发现c.146T>G(p.I49S). c.303G>A(p.G101G)和c.546G>A(p.P182P)的等位基因频率以及基因型频率在POF组及对照组之间均无显著性差异(P>0.05)。对AMHR-Ⅱ基因中的12个POF组及对照组均出现的SNP(其中11个为新发现的SNP)进行统计学分析,发现c.49+10T>G, c.622-6C>T、C.622-24C>A的基因型以及等位基因频率在POF组和健康对照组之间存在显著差异(P<0.05),c.1038G>T的基因型频率在POF组和健康对照组之间有显著差异(P<0.05),但其等位基因频率在两组之间无显著差异(P>0.05)。其余的8个多态性位点(包括既往已发现的c.-482A>G)的基因型、等位基因频率在病例组和健康对照组之间均无显著差异(P>0.05)。使用二分类Logistic回归计算分析上述4个突变位点是否为特发性POF的发病危险因素,结果显示,c.49+10T>G、c.622-6CT、c.622-24C>A在特发性POF组和健康对照组之间有显著差异(P<0.05),c.1038G>T在病例组和对照组之间无显著差异性(P>0.05)。5、结论(1) AMHR-Ⅱ基因编码的第209位异亮氨酸和第354位亮氨酸在生物进化过程中处于高度保守状态；p.1209N可能是影响其编码蛋白质功能的突变,而L354F可能不对AMHR-Ⅱ蛋白质功能造成影响。(2) c.1461>G(p.I49S)、c.303G>A(p.G101G)和c.546G>A(p.P182P)的等位基因频率以及基因型频率在POF组及对照组之间均无显著性差异(P>0.05),提示AMH基因中的上述3个突变位点可能与中国汉族特发性POF的基因学、病因方面无相关关系。(3) AMHR-Ⅱ基因中c.49+10T>G、c.622-6CT、c.622-24C>A基因型在POF组和健康对照组之间分布有显著性差异,采用二分类Logistic回归计算分析亦得出上述3个突变位点可能为特发性POF的发病危险因素,提示AMHR-Ⅱ基因突变可能在特发性POF的遗传分子学、病因学方面起着重要作用。(4) AMHR-Ⅱ基因突变可能是中国汉族特发性POF的病因,而AMH基因的变异可能不是中国汉族特发性POF的病因,以上结论亟待进一步研究。