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本文主术节旋藻分类学地位及生产性状的分子标记进行了研究,文章分以下三部分展开了论述:
一、基于16S rRNA的节旋藻与螺旋藻分类学地位研究
测定了本实验室保存的10株节旋藻品系Sp-4、Sp-6、Sp-7、Sp-8、Sp-12、Sp-14、Sp-15、Sp-16、Sp-17和Sp-18的16S rRNA基因序列,进而与GenBank上有关品种(系)的16S rRNA基因序列作同源性分析,并构建了颤藻目下属间的系统发生树。结果表明:(1)节旋藻和螺旋藻之间的亲缘关系相距较远,支持了《伯杰氏系统细菌学手册》重新分立节旋藻属和螺旋藻属的观点。(2)节旋藻稳定族群与由颤藻和浮游蓝丝藻构成的族群亲缘关系相近,节旋藻品种(系)间16S rRNA基因序列的相似性高于99%,表明该属的界限、定义明确。(3)7株螺旋藻在系统树上的分布较离散并分成两个分支。第一个分支由AB2002/06与FACHB351组成,它们16S rRNA基因序列的相似性为98.1%,并与盐螺旋藻CCCBa-ja-95C1.3和MPI S3构成一个族群;其余5株螺旋藻组成另一分支,品种(系)间16S rRNA基因序列相似性大于96%。这两个分支品系间16S rRNA基因序列的相似性仅为92%,与颤藻目下大多数属间的相似性程度在同一水平。(4)Sp-12虽处于节旋藻稳定族群内,但单独处于该族群的最外围,明显有别于其它节旋藻品系。这主要是由于该品系16S rRNA基因序列中,只有后1192 bp与其它节旋藻的高度同源,但前320 bp与其它节旋藻品系的相似性只有约66%,而与弯杆菌属Flectobacillus rubber和Bellia baltica BAl的相似性却高达90%和89%。推测Sp-12的16S rRNA基因序列可能来源于弯杆菌属品系与节旋藻属品系间的基因水平转移。
二、钝顶节旋藻品系间的亲缘关系研究
测定了16株钝顶节旋藻品系16S rRNA、16S-23S ITS、23S rRNA和cpcHID操纵子序列,并基于这些序列分别用超级树和超级矩阵法构建了系统树,探讨钝顶节旋藻品系间的亲缘关系。(1)在用超级树法构建系统树时,先以16S rRNA基因将16株节旋藻品系分成了3簇,自展值(Bootstrap)高达100%;再用16S-23SrRNA ITS区分第1I簇中的Sp-14;尔后用cpcHID操纵子序列分别构建出第Ⅱ、Ⅲ簇的亲缘关系树;最后将上述3步构建的子树合成超级树。(2)在用超级矩阵法构建系统树时,先将16S rRNA、16S-23S ITS、23S rRNA和cpcHID操纵子4个基因串成一个4084 bp的串联序列,再分析品系间该序列的相似性与遗传距离,进而构建出亲缘关系树。(3)用两种方法构建的系统树基本一致,整个系统树分成界定明确的3大簇:第1簇由Sp-11单独形成,第Ⅱ簇由Sp-1、Sp-2、Sp-6、Sp-9、Sp-10、Sp-14和Sp一18组成,第Ⅲ簇由Sp-3、Sp-4、Sp-5、Sp-7、Sp-8、Sp-15、Sp-16和Sp-17组成。两棵系统树的主要差异在于第Ⅱ簇,超级矩阵法将该簇分成由Sp-6、Sp-14和Sp-18组成的一个分支和Sp-1、Sp-2、Sp-9和Sp-10组成的另一分支;而利用超级树法,第Ⅱ簇的所有品系组成同一支系。
三、节旋藻生产性状优劣评价的若干分子标记
在多年研究与生产实践的基础上,建立了4种能简单、快速、有效初步评价节旋藻生产性状的分子标记技术。分别如下:(1)以节旋藻生产性状差的第1类品系与生产性状好的第Ⅱ类品系,在16S-23S rRNA ITS中碱基位点有显著共性差异、分别位于1~50 bp和281~400 bp的序列(称为ITS-Markerl和ITS-Marker2),作为生产性状优劣评价的分子标记。(2)以节旋藻生产性状差的第1类品系与生产性状好的第Ⅱ类品系,CpcI第1~80位氨基酸序列中第7、20、30、56和72位的共性差异,作为生产性状优劣评价的分子标记。(3)以随机引物S35和S99分别对生产性状差的第Ⅰ类和生产性状好的第Ⅱ类节旋藻品系作RAPD扩增显示出的特征性差异条带为标记,评价节旋藻品系生产性状的优劣。即S35和S99的扩增条带分别为900 bp和650 bp者,属第1类品系;扩增条带分别为680 bp和900 bp者,属第Ⅱ类品系。(4)生产性状差的第Ⅰ类节旋藻品系的总DNA中只含1条exDNA,而生产性状好的第Ⅱ类品系有2条exDNA,可以此作为分子标记评价节旋藻生产性状的优劣。