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脓毒症是临床常见的全身性炎症反应综合症,感染、创伤、烧伤、休克等均是其诱因,且死亡率高,是临床常见的并发症之一。研究表明,脓毒症早期机体会产生过度、过多的促炎因子,虽然促炎反应有利于清除病原菌,但过度的炎症反应会导致细胞过度焦亡,增加机体的免疫损伤。炎症小体在炎症反应中具有重要作用,它是由模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs)检测病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)和损伤相关分子模式(damage-associated molecular patterns,DAMPs)后,直接或者通过ASC接头蛋白同Pro-Caspase-1蛋白形成的复合物,随即使Caspase-1活化,剪切Pro-IL-1β和Pro-IL-18,并释放IL-1β和IL-18,这也称为经典炎症小体。2011年Kayagaki研究发现Caspase-11是小鼠革兰氏阴性菌脓毒症死亡的主要原因,并由此提出了非经典炎症小体。非经典炎症小体以Caspase-11为核心,Caspase-11作为胞内模式识别受体识别胞内革兰氏阴性菌细胞壁成分脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS),与LPS结合后发生寡聚化而活化,继而使细胞发生炎性焦亡,以抵御革兰氏阴性菌感染,但是非经典炎症小体的调控机制一旦失调,则可能会引起非经典炎症小体的过度激活,最终导致脓毒症死亡,所以亟需对非经典炎症小体的调控机制进行研究。研究发现,泛素化在经典炎症小体中具有重要的调控作用,ASC的线性泛素化是NLRP3经典炎症小体激活所必须的,泛素化编辑酶A20亦可通过阻断NF-κB通路下调NLRP3、Pro-IL-1β和Pro-IL18的表达,从而负调控NLRP3经典炎症小体。我们实验室成员在国外博士后研究期间发现E3泛素化连接酶Cbl-b通过泛素化修饰NLRP3蛋白负调控炎症小体的激活,但是到目前为止关于泛素化对非经典炎症小体的调控作用仍未见报道。Nedd4是一种重要的HECT型E3泛素连接酶,在多种细胞中表达,且具有多种底物分子,参与着众多生理过程,研究发现,Nedd4可通过泛素化Cbl-b促进Th细胞活化,在B细胞中Nedd4可通过对TRAF3 K63形式的泛素化调节CD40介导的AKT通路,参与着免疫球蛋白类型的转换。说明Nedd4在获得性免疫的调控中具有重要作用,但是在天然免疫中的作用,尤其是对非经典炎症小体的调控作用及机制需进一步探讨,因此本研究将探讨Nedd4对非经典炎症小体的调控作用及机制,为以后干预由革兰氏阴性菌所引起的脓毒症提供理论依据。第一部分 Nedd4对非经典炎症小体调控作用的研究本部分研究旨在探讨Nedd4对非经典炎症小体的调控作用。首先利用Nedd4+/-小鼠在小鼠水平探讨Nedd4对非经典炎症小体的调控作用。利用低剂量LPS(400ng/kg)腹腔注射Nedd4+/-和野生型小鼠进行引发(Priming)7小时,然后使用高剂量LPS(10mg/kg)刺激小鼠(activation),建立非经典炎症小体激活模型,观察小鼠24小时内存活率,检测血清中IL-1β含量,HE染色观察脏器炎性损伤。随后在细胞水平探讨Nedd4对非经典炎症小体的调控作用。利用CRISPR/Cas9技术建立Nedd4敲除的BMDM细胞系。使用LPS(500ng/ml)引发Nedd4敲除及其对照细胞4小时,然后按照1×106/ug LPS进行电转,建立非经典炎症小体激活模型,2.5小时后收集细胞培养上清,检测LDH释放。此外使用LPS(500ng/ml)引发Nedd4敲除及其对照细胞7小时,将LPS浓度调整为2ug/ml同时使用8(16)ug/ml CTB介导LPS进入细胞内部,16小时后收集细胞培养上清检测LDH释放,对电转实验结果进行验证。结果表明,相对于野生型小鼠,Nedd4+/-小鼠生存率显著降低,血清中IL-1β含量显著升高,心肝具有较严重的炎性损伤;细胞实验结果显示,相对于对照组,Nedd4敲除后细胞死亡率显著升高,且呈现CTB剂量依赖效应。本部分实验结果提示,Nedd4对非经典炎症小体具有抑制作用,这为下一步研究调控的分子机制奠定了基础。第二部分 Nedd4对非经典炎症小体调控作用的机制研究本部分研究在第一部分研究结果的基础上,以非经典炎症小体的核心分子Caspase-11为切入点,在m RNA水平和蛋白水平初步探讨Nedd4调控非经典炎症小体的分子机制,一、Nedd4对Caspase-11蛋白m RNA水平调控的研究本章节探究Nedd4对Caspase-11蛋白m RNA水平调控作用,通过序列分析,Caspase-11的上游分子p38αVariant2具有Nedd4所特异性识别的结构域,推测p38α可能为Nedd4的底物分子,Nedd4通过调控p38MAPK通路调控Caspase-11 m RNA水平。首先利用Real-time PCR的方法探讨Nedd4对Caspase-11 m RNA的调控作用,然后利用LPS刺激Nedd4稳定敲低(敲除)及其对照细胞,293T细胞共转,MG132和氯喹阻断等实验手段,通过ELISA、双荧光素酶报告系统、Western blot技术、免疫共沉淀、Ni-NTA纯化、质谱分析等方法进一步进行研究。与对照组相比,Nedd4稳定敲低(敲除)组Caspase-11的m RNA水平显著升高;TNF-α的分泌显著增加;p-p38(p38)的蛋白水平显著升高;双荧光素酶报告实验发现Nedd4抑制转录因子AP-1活性;p-p38(p38)蛋白经泛素化由蛋白酶体和溶酶体途径进行降解;Co-IP实验结果显示,磷酸化影响Nedd4与p38αV1的相互作用,但对Nedd4与p38αV2的相互作用没有影响;泛素化实验结果表明,Nedd4参与着p38αK48和K63两种形式的泛素化,磷酸化显著增强Nedd4对p38αV1/2的K48形式的泛素化;质谱分析发现,p38αV1在K45、K53(K54)和K152位点具有泛素化修饰,p38αV2的K53(K54)、K287和K295位点具有泛素化修饰,K53(K54)位点是共有的泛素化位点。该实验结果提示:Nedd4可通过对p38α直接泛素化使其进行降解,起到对p38MAPK通路的负调控作用,从而实现对Caspase-11 m RNA的负调控。二、Nedd4对Caspase-11蛋白水平调控的研究本章主要研究Nedd4在蛋白水平对Caspase-11的调控作用,并初步探讨其分子机制。如第一章所述方法,使用LPS刺激、293T细胞共转,mg132和氯喹阻断等实验手段,通过Real-time PCR、Western blot技术、免疫共沉淀、Ni-NTA纯化等检测方法进行探讨。与对照组相比,Nedd4稳定敲低(敲除)组的Caspase-11蛋白水平显著升高;Caspase-11蛋白经泛素化由蛋白酶体途径进行降解;Co-IP实验发现,Nedd4可与Caspase-11蛋白发生直接的相互作用;泛素化实验表明,Nedd4对Caspase-11蛋白具有直接的泛素化作用。该结果提示Nedd4可通过与Caspase-11蛋白的直接相互作用对其进行泛素化,使其进入蛋白酶体进行降解,说明Nedd4可直接在蛋白水平调控Caspase-11。综上所述:本研究通过一系列实验探讨Nedd4对非经典炎症小体的调控作用,并对其调控机制进行初步研究。结果表明,Nedd4对非经典炎症小体具有负调控作用。Nedd4可通过负调控p38αMAPK通路实现对非经典炎症小体的核心分子Caspase-11 m RNA水平的调控作用,同时Nedd4可直接泛素化Caspase-11使其进行降解,从而实现对Caspase-11蛋白水平的调控。Nedd4在m RNA水平和蛋白水平对Caspase-11蛋白进行调控,从而实现对非经典炎症小体的调控,这为后期临床干预革兰氏阴性菌脓毒症奠定了理论基础。