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目的:
建立可于单一体系中同时直接检测下呼吸道标本中鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii,Ab)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,sp)、b型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae type b,Hib)与结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosis complex,MTBC)的多重降落PCR检测方法。并应用临床标本与细菌培养法比较验证所建立的多重降落PCR检测方法的灵敏度与特异性。
方法:针对鲍曼不动杆菌blaoXA-51-like基因、b型流感嗜血杆菌capⅡ区、肺炎链球菌cpsA基因、Hib capⅡ区、结核分枝杆菌复合群插入序列IS6110为靶标分别设计4对特异性引物,应用Primer-BLAST检测引物特异性;根据所设计的相关引物建立对应的单-PCR,并使用自纯培养菌株提取的基因组DNA验证其特异性与检测限;在所建立的单一PCR的甚础上建立多重降落PCR,对反应条件进行优化,使用标准菌株验证其检测限与特异性;进一步使用492份痰标本与细菌培养法比较验证所建立的多重降落PCR检测方法的临床灵敏度与特异性。
结果:
1.细菌培养:492份痰标本共培养出47份鲍曼不动杆菌、25份肺炎链球菌、7份b型流感嗜血杆菌、10份结核分枝杆菌复合群。
2.单一PCR:所建立的鲍曼不动杆菌、b型流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、结核分枝杆菌复合群单一PCR分别于353 bp、177 bp、653 bp、494 bp处扩增出特异性条带,与其它菌株之间无非特异性扩增:相应的检测限分别为0.82 Pg、0.2 Pg(相当于0.2 CFU)、6.3 Pg(相当于16 CFU)、0.02 Pg(相当于8基因组拷贝)。
3.多重降落PCR:在单一PCR的基础上成功建立可同时检测鲍曼不动杆菌、b型流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、结核分枝杆菌复合群的多重降落PCR检测方法,其对鲍曼不动杆菌、b型流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、结核分枝杆菌复合群的检测限分别为8.2pg、2Pg(相当于2CFU)、63 Pg(相当于160CFU)、0.02Pg(相当于8基因组拷贝)。
4.临床标本验证:与细菌培养法相比,所建立的多重降落PCR检测方法对492份痰标本中鲍曼不动杆菌、b型流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、结核分枝杆菌复合群的检测灵敏度达100%,特异性分别达98%、94%、98%、98%。
结论:成功建立了可于单管中同时检测临床标本中鲍曼不动杆菌、b型流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、结核分枝杆菌复合群的多重降落PCR检测方法,并经临床痰标本验证了其效能,证实其快速且具有高度特异性与灵敏度,有利于呼吸道感染性疾病的临床快速检测诊断及大规模流行病学研究。