【摘 要】
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目的 建立以加强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)为报告基因检测人单纯疱疹病毒(herpes simplex virus,HSV)感染的细胞株。 方法 提取HSV-2 DNA
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目的 建立以加强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)为报告基因检测人单纯疱疹病毒(herpes simplex virus,HSV)感染的细胞株。 方法 提取HSV-2 DNA,利用DNA Star软件设计对应于HSV-2(Sal 5株)ICP10启动子的PCR引物,引入BgI Ⅱ和Hind Ⅲ酶切位点。PCR扩增目的基因片段,将回收纯化的PCR产物连接至pMD18-T载体构建亚克隆,切下目的基因,连接至真核表达载体pEGFP-1构建重组质粒pICP10-EGFP,经双酶切和DNA测序鉴定后,以阳离子脂质体法(Lipofectamine2000)转染Vero细胞。转染48h后,加入G418(400μg/ml)筛选阳性细胞克隆,进行放大培养建立稳定转染细胞株Vero-ICP10-EGFP细胞。以不同量的HSV-2感染Vero-ICP10-EGFP细胞,分别于感染后6h、8h、10h,以倒置荧光显微镜检测GFP荧光。 结果 经PCR扩增获得641bp大小的目的基因片段,构建的重组质粒pICP10-EGFP经双酶切及DNA测序鉴定,表明重组正确。重组质粒pICP10-EGFP转染Vero细胞后,以G418筛选11天出现阳性细胞克隆,建立的稳定转染细胞株Vero-ICP6-EGFP细胞经HSV-2诱导感染,最早于6h即可在倒置荧光显微镜下检测到GFP绿色荧光,随着时间的增加,GFP荧光的量及强度逐渐增加。 结论 本研究建立的以EGFP为报告基因的Vero-ICP6-EGFP细胞株具有早期、快速、灵敏等优点,特异性较高,进一步完善后有望用于HSV-2感染的快速诊断及抗病毒药物的筛选。
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