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一些酚类化合物(PhenolicCompounds,PCs)及3,4-二氯苯胺(Dichloroaniline,DCA)对生物体具有致癌性、致畸性和致突变性。这些物质中许多是农药、防腐剂、消毒剂和偶氮染料等合成和代谢的中间体。由于这些物质的广泛使用,对水资源和土壤造成了污染。它们通过土壤和水体等进入生物链,并最终危害着人类的健康。 糖基转移酶(Glycosyltransferases,GTs,EC2.4.x.y)是一类催化糖基化反应的酶,能够将糖基从供体分子转移到特定的受体分子上,从而形成糖苷物。尿苷二磷酸-糖基转移酶(UridineDiphosphate-glycosyltransferases,UGTs)是GTs1家族的成员。在植物体内这类酶催化糖基化反应时,以UDP-糖为糖基供体将糖基转移到植物激素、次生代谢物、病原菌侵染物以及异源毒素等一系列小分子化合物受体上,从而改变其生物活性、水溶性和稳定性等特性。一些PCs及3,4-DCA因其苯环上带有羟基或氨基,能够被植物体内许多种糖基转移酶糖基化形成糖苷物而毒性降低。 葡萄(Vitisspp.)是世界第二大果树,自古以来深受人们的喜爱。一些农药的使用和污染水源的灌溉等使得一些有害的PCs和3,4-DCA进入葡萄植株。而这些物质在进入葡萄植株后,如何被转化以及是否会通过果实进入人体都鲜为人知。杨树(Populusspp.)因其生长快、成熟后个体大、对有毒物质抗性强、能降解许多污染物,同时也能带来一定的经济效应,是上佳的研究植物修复的木本植物。 葡萄和杨树的全基因组测序已经完成,这为基因功能的研究带来了便利。本文根据拟南芥中对2,4,5-三-氯苯酚(Trichlorophenol,TCP)和3,4-DCA糖基化能力最强的AtUGT72B1氨基酸序列,在NCBI数据库中搜索得到葡萄和杨树中与之同源性最高的蛋白各一个(GenBankAccessionNo:XP_002280923,XP_002320190)。将这两个蛋白对应的基因分别命名为VvUGT72B1基因和PtUGT72B1基因。通过修饰,并按照PTDS方法合成这两个基因。将这两个基因分别转入毕赤酵母中高量表达,通过筛选和鉴定得到了能够分别高量表达这两种蛋白的阳性菌株。将获得的毕赤酵母阳性菌株进行扩大培养,提取酵母中的蛋白从而获得重组酶。通过试验验证了VvUGT72B1能够将2,4,5-TCP、2,6-二甲基苯酚(Dimethylphenol,DMP)、苯酚、对苯二酚、邻苯二酚、3-甲基邻苯二酚(Methylcatechol,MC)和3,4-DCA糖基化,并提高了酵母对其抗性;PtUGT72B1能够将苯酚、邻苯二酚和对苯二酚糖基化,并提高了酵母对其抗性。2,4,5-TCP、苯酚、对苯二酚和邻苯二酚被糖基化后的产物分别是2,4,5-TCP-O-葡萄糖苷、苯基葡萄糖苷(Pheny1β-D-glucopyranoside,PGPS)、熊果苷和邻羟基苯基葡萄糖苷。同时还检测了这两种酶对各自底物的活性。通过测定米氏常数表明PtUGT72B1对邻苯二酚、苯酚和对苯二酚的亲和力依次递减。 将VvUGT72B1基因和PtUGT72B1基因分别转入模式植物拟南芥进行研究,以便能在将来把这两个基因能真正应用到植物修复当中。通过农杆菌蘸花法转化拟南芥,经过筛选和检测获得能够分别表达这两个基因的阳性株系。除了苯酚以外,表达葡萄VvUGT72B1的拟南芥对其余五种所测酚类化合物和3,4-DCA的抗性比野生型拟南芥高。表达杨树PtUGT72B1的拟南芥株系对邻苯二酚和对苯二酚的抗性比野生型拟南芥提高。而表达VvUGT72B1和PtUGT72B1的拟南芥株系对苯酚的抗性比野生型拟南芥明显降低。降解试验结果表明,两种转基因拟南芥对各自所测底物的降解能力比野生型拟南芥明显提高,体内生成的糖苷物含量也比野生型拟南芥高。同时,检测到从表达VvUGT72B1或PtUGT72B1拟南芥中提取的粗酶对各自所测底物的糖基化能力比野生型拟南芥都要高。表明2,4,5-TCP、2,6-DMP、对苯二酚、邻苯二酚、3-MC和3,4-DCA在拟南芥体内被糖基化后对拟南芥的毒性降低,而苯酚在拟南芥体内被糖基化后形成的PGPS对拟南芥的毒性增高。然而,由于拟南芥对PGPS的吸收能力远不及苯酚,使得野生型拟南芥在含PGPS的培养基上的长势比在含有相同摩尔浓度的苯酚的培养基上的长势好。此外,拟南芥对熊果苷的吸收能力也远不及对苯二酚,使得野生型拟南芥在含熊果苷的培养基上的长势比在含有相同摩尔浓度的对苯二酚的培养基上的长势好。 在本研究中,新发现了拟南芥能够将体内生成的苯酚、2,6-DMP和3-MC的糖苷物排出体外,并检测到拟南芥能够将体内生成的3,4-DCA的糖苷物排放到体外。HPLC分析结果表明,转基因拟南芥比野生型的拟南芥所排出的糖苷物要快。本试验可以为一些有害PCs和3,4-DCA污染的植物解毒修复提供很好的技术支持