HCV是一种非甲非乙型肝炎病毒,后命名为丙型肝炎病毒,归属于肝病毒属(Hepacivirus),黄病毒科(Flaviviridae)。丙型肝炎是一种由丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus, HCV)感染引起的病毒性肝炎,主要通过输血、针刺、吸毒等血液途径传播。据世界卫生组织统计,目前全世界范围内,大约有1.8亿人感染了丙型肝炎病毒,仅中国就有大约4千万名HCV感染者,感染率约为3.2%,是HCV感染的高流行区。丙型肝炎病毒感染者中55%～85%发展成为慢性肝炎,其中5～25%进一步发展为诸如肝硬化等复合慢性肝病,并且每年又有约1～4%的人发展为肝癌(HCC),研究揭示78%原发性肝癌由HCV慢性感染导致。HCV病毒基因组序列具有高度的多态性,主要可分为11种不同的基因型,70多种亚型。我国感染HCV主要以1b和2a型常见,特别是1b型,约占整人群的70%。且1b型HCV完整结构蛋白基因序列与现有基因型1a、1b、2a、2b、3、4、5和6型丙型肝炎病毒之间的核苷酸序列同源性为69.1%。HCV病毒体呈球形,为单股正链RNA病毒。HCV-RNA全长约为9.6kb,其基因组由结构(核心,囊膜)和非结构(蛋白酶,螺旋酶,酶辅助因子)蛋白及非编码区组成。位于基因中央的开放阅读框(ORF)编码3000多氨基酸的前体多聚蛋白,其通过宿主和病毒的蛋白酶作用被切割成10个具有独立功能的HCV蛋白,根据功能的不同分别命名为核心蛋白Core(C),包膜蛋白1、2(E1、E2),p7和非结构蛋白NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B。其中HCV核心区是HCV进行基因和血清分型的靶基因区,也是从基因水平上治疗HCV感染和进行疫苗研究的重要区域,而且核心区基因最为保守,其编码的抗原免疫性最强。丙型肝炎病非结构蛋白NS3(1192-1457aa)具有丝氨酸蛋白酶、解旋酶和NTP酶活性,是HCV病毒复制中重要的功能蛋白之一。NS3蛋白C末端2/3氨基酸构成HCV NS3解旋酶(helicase),发挥三磷酸腺苷酶(ATPase)和解旋酶作用,使双链RNA解旋,对HCVRNA复制起到重要作用。同时,NS3解旋酶含有大量B细胞优势表位,能在HCV感染早期诱导机体发生体液免疫反应,产生抗体。Core和NS3抗原相应的抗体出现早、分布广、亲和力强,因此Core和NS3蛋白已成为当今血液筛查诊断试剂的主要原料。目前对丙型肝炎病毒感染者的筛查仍缺乏十分有效的快速诊断试剂。我国献血者HCV感染筛查使用的两遍Elisa检测方法符合率仅在50%左右,假阳性率高达30%,对献血者队伍造成极大损害。当前检查方法使用的抗原为重组大肠杆菌表达的Core、NS3、NS4和NS5等抗原,存在反应性弱、非特性强等不足,严重影响了HCV抗体检测的准确性。利用真核表达系统表达HCV抗原,其加工修饰过程更利于氨基酸链折叠为天然构象的蛋白,具有更高的特异性。且真核表达系统表达的蛋白有更低的免疫原性,可降低原核表达系统带来的非特异性。Huh7.5.1细胞系来源于人肝癌细胞系,是用于体外HCV相关研究的主要细胞系,相比于其他组织细胞更易于表达HCV相关蛋白,且加工折叠后的蛋白更接近天然蛋白的构象与活性,可用于HCV Core和NS3蛋白的大量表达。慢病毒(Lentivirus,LV)为一类逆转录病毒的亚群。由HIV-1改建而来的慢病毒载体系统以其高效而稳定的基因转移效率而成为近年来研究者们的主要选择。由于LV既能感染处于分裂期的细胞,又能感染处于非分裂期的细胞,而且由LV携带整合入宿主基因组的目的基因对转录沉默作用有较强的抵抗力,使得目的基因可在宿主细胞内长期而稳定表达。同时,慢病毒感染目的细胞的过程与天然HCV病毒感染细胞的过程比较相似,但慢病毒无法自我复制,具有较高的生物安全性。综上所述,与其他逆转录病毒载体相比,LV具有较高的基因转导效率,蛋白表达具有长期稳定性及较高的生物安全性。因此,以携带重组HCVCore和NS3基因的慢病毒载体为表达载体,包装为重组慢病毒后感染目的细胞促使其大量表达Core及NS3抗原的方法具有重大优势与意义。我们通过从含有1b型HCV Core全长基因的质粒SQT7DH-5和含有NS3全长基因的pMD20NS2-4A质粒中分别扩增Core和NS3目的基因,同时通过引物设计分别在Core蛋白和NS3蛋白的N端引入分泌型亲水信号肽SP(MWTLVSWVALTAGLVAG),C端添加6His标签。即从N末端至C末端为SP-Core/NS3-6His,并将目的序列插入慢病毒载体pHAGE-fullEF1α-MCS-IZsGreen,构建为表达载体pHAGE-fullEF1α-Core-MCS-IZsGreen和pHAGE-fullEF1α-NS3-MCS-IZsGreen。利用脂质体转染的方式将构建好的慢病毒载体与病毒包装辅助质粒pMD2.G和psPAX2按一定比例转染293T细胞,通过293T细胞包装成具有感染活性的携带有HCV Core和NS3基因的重组慢病毒LV-Core和LV-NS3。将一定量的LV-Core和LV-NS3感染人肝癌细胞系Hun7.5.1细胞,其RNA能逆转录为cDNA并与目的细胞的基因组相整合,从而特异性地促进Huh7.5.1细胞大量表达HCV Core和NS3抗原。Huh7.5.1细胞内表达的可溶性NS3蛋白由于带有6His的组氨酸标签,可将细胞裂解后通过Ni-NTA和CNBr-4B偶联特异性抗体柱亲和层析纯化。Core蛋白是强碱性蛋白,可通过阳离子交换的方法纯化,获得一定纯度的NS3和Core蛋白。通过上述实验方法,用分子克隆常规方法构建并鉴定了正确的含有目的蛋白基因的表达载体pHAGE-fullEF1α-Core-MCS-IZsGreen和pHAGE-fullEF1α-NS3-MCS-IZsGreen,并通过瞬时转染293T的方法初步鉴定了这两个质粒能在真核细胞中正确表达目的蛋白和标签蛋白,目的蛋白存在于细胞内。通过共转染构建好的慢病毒表达质粒和第三代慢病毒包装系统的另两个辅助质粒至293T,分别包装得到了基因拷贝数为2.3×109copies/ml的LV-Core病毒上清和基因拷贝数为3.3×108copies/ml的LV-NS3病毒上清。将一定量的重组慢病毒分别感染Huh7.5.1、CHO和293A细胞后通过观察绿色荧光标签蛋白和免疫荧光染色发现Huh7.5.1相比于293A细胞更容易被重组慢病毒所感染。免疫荧光检测和WesternBlot分析显示,重组HCV Core和NS3蛋白都主要分布于胞浆内。通过裂解细胞,将裂解上清和细胞碎片沉淀分别做Western Blot,发现Core和NS3蛋白都是部分可溶,并且NS3的亲水性要高于Core。由于通过慢病毒整合到Huh7.5.1细胞中的Core和NS3基因能持续表达,将感染了重组慢病毒并鉴定能正确表达目的蛋白的Huh7.5.1大量培养后收集细胞,破碎后取上清。利用NS3蛋白C端的6his标签蛋白与金属离子Ni2+的亲和性,用亲和层析的方法初步纯化从细胞中裂解出来的可溶性NS3蛋白,再用偶联了NS3特异性单克隆抗体的CNBr4B填料进一步纯化NS3,得到纯度约为80%的纯化后NS3蛋白。本课题采用相近于HCV复制的新型慢病毒介导的真核表达系统,兼具慢病毒表达载体和真核表达系统的优点,制备Core和NS3抗原,建立大规模生产与纯化工艺,为献血者HCV感染筛查或临床诊断提供新一代免疫测定新型抗原。