【摘 要】
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鼠伤寒沙门菌是导致沙门菌感染的主要血清型之一。随着治疗多重耐药革兰氏阴性菌引起感染的多黏菌素在临床中的使用量增加,多重耐药沙门菌的分离率随之增多。因此研究鼠伤寒沙门菌对多黏菌素的耐药机理具有重要意义,寻找多黏菌素增敏剂有望成为防止耐药性产生的有效途径。本研究将鼠伤寒沙门菌标准株（AT）感染秀丽隐杆线虫（N2）,构建“AT-N2”耐药模型,在多黏菌素的压力下筛选出体内诱导多黏菌素耐药菌TN-P128
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鼠伤寒沙门菌是导致沙门菌感染的主要血清型之一。随着治疗多重耐药革兰氏阴性菌引起感染的多黏菌素在临床中的使用量增加,多重耐药沙门菌的分离率随之增多。因此研究鼠伤寒沙门菌对多黏菌素的耐药机理具有重要意义,寻找多黏菌素增敏剂有望成为防止耐药性产生的有效途径。本研究将鼠伤寒沙门菌标准株（AT）感染秀丽隐杆线虫（N2）,构建“AT-N2”耐药模型,在多黏菌素的压力下筛选出体内诱导多黏菌素耐药菌TN-P128。以AT和TN-P128为研究对象,比较分析两株菌在生物学特性、基因组组分和基因表达量方面的变化,探明鼠伤寒沙门菌对多黏菌素耐药性的影响,为研究体内耐药机理提供思路。然后以耐药菌TN-P128为研究对象,将8种中药单体分别联合多黏菌素进行体外抗菌试验,从中筛选可以逆转多黏菌素耐药性的增敏剂,为进一步寻找恢复多黏菌素抗菌活性的途径提供理论基础。主要研究内容和结果如下:（1）耐药菌诱导及生物学特性研究。在多黏菌素的浓度压力作用下成功筛选出耐药菌TN-P128。与AT相比,TN-P128在沙门菌显色板与DHL平板中均无法正常生长,脱氧胆酸耐受试验证实TN-P128对脱氧胆酸敏感性显著增加;药物敏感性方面,TN-P128除了对多黏菌素B的敏感性显著降低256倍外,对氟苯尼考、泰拉霉素、加米霉素、四环素和多西环素等的敏感性降低2-64倍,而对β-内酰胺类、氨基糖苷类、磺胺类和替加环素的敏感性无明显变化;TN-P128的生长速率无明显变化,细菌运动能力和生物膜形成能力均出现明显下降现象。说明鼠伤寒沙门菌对多黏菌素耐药性的产生会影响其对部分抗菌药物的敏感性,并以减弱运动能力,生物膜形成能力和对胆盐的抗性等方式来抵御外界环境的刺激来维持自身的存活。（2）全基因组学分析。将AT和TN-P128进行全基因组测序,结果显示,AT的基因组大小为4 643 662 bp,TN-P128基因组大小为4 643 159 bp,两个样品的GC含量均为52%,基因组组分和功能方面的预测结果基本一致。CARD注释到47个耐药基因。单核苷酸多态性（SNPs）分析可知,TN-P128基因组中有7个基因发生了SNPs位点,分别是ccm G、acr B、bas S、rps A、glo B、nha C和STM3357,其中acr B和bas S均发生错义突变且与细菌耐药性相关,说明基因突变可能是鼠伤寒沙门菌产生多黏菌素耐药性的原因之一。（3）转录组学分析。体内诱导多黏菌素耐药后出现了383个差异显著表达基因,其中133个基因表达量上调,250个基因表达量下调。GO功能注释差异表达基因主要富集在多生物过程、蛋白质分泌、细胞分泌、细胞成分组装、氧化还原酶活性、铁离子结合等功能。KEGG通路注释差异表达基因主要富集在沙门菌感染、双组分系统、鞭毛组装、脂多糖生物合成、细菌分泌系统、细菌趋化性等途径。随机选取7个差异表达基因进行q RT-PCR验证,结果与转录组结果基本一致。其中脂多糖修饰相关基因（ugd、arn T、arn E、dgk A、cpt A）的表达量显著增加,提示多黏菌素耐药的主要途径可能与脂多糖修饰有关。（4）中药单体联合多黏菌素对耐药菌TN-P128的体外抗菌活性研究。微量棋盘稀释法结果显示,多黏菌素（PB）与查尔酮、苦参碱、辣椒素和兰雪醌分别联合使用对TN-P128呈现协同作用;PB与青蒿素和黄芩素分别联合使用对TN-P128呈现相加作用;多黏菌素与熊果酸和葛根素分别联合使用对TN-P128呈现无关作用。筛选出抑菌效果最佳组合PB+查尔酮、PB+苦参碱和PB+辣椒素进行时间-杀菌曲线验证,结果显示,在24 h时三个联合组的细菌数量与单药组相比均有明显下降,呈协同作用。杀菌曲线结果与棋盘法结果一致,说明查尔酮、苦参碱和辣椒素可有效增强多黏菌素对TN-P128的体外抗菌活性。本研究成功构建鼠伤寒沙门菌体内诱导多黏菌素耐药株,通过比较耐药前后沙门菌在生物学特性和基因水平的变化,分析鼠伤寒沙门菌在多黏菌素压力下的表型变化和耐药机理。然后以体内诱导多黏菌素耐药菌为研究对象,进行8种中药单体与多黏菌素联合的体外抑菌效果评价,初步探寻潜在的多黏菌素增敏剂,为多黏菌素耐药菌的防控以及逆转耐药性的深入研究提供理论基础。
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