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目的:将编码GGC肽(diglycylcysteine,双甘氨酰半胱氨酸)的基因序列与人生长抑素2a型受体(hSSTr2a)基因的膜外N端开放阅读框相连接,构建融合受体重组腺病毒载体Ad5-GGC-hSSTr2a-IRES-EGFP。通过体外受体结合试验、细胞摄取试验、核素报告基因显像等一系列体外与体内实验研究,探讨以GGC序列为报告基因进行核素报告基因显像的可行性,以期建立一种新型的核素报告基因显像系统。方法:1.重组腺病毒载体Ad5-GGC-hSSTr2a-IRES-EGFP的构建与表达鉴定。采用RT-PCR方法扩增hSSTr2a基因全长cDNA序列,将GGC肽的基因序列(亲水序列P1,疏水序列P2)与hSSTr2a的膜外N端开放阅读框相连接,通过一系列基因工程技术构建同源重组腺病毒骨架质粒pAdEasy-1/GGC-hSSTr2a-IRES-EGFP (pAd-SIG-P1, P2)。提取pAd-SIG-P1和pAd-SIG-P2质粒并转化大肠杆菌DH5a感受态细胞,酶切线性化后经脂质体(Lipofectamine2000)介导转染HEK293细胞,同源重组产生融合受体重组腺病毒载体Ad5-GGC-hSSTr2a-IRES-EGFP ( Ad5-P1/STR ,Ad5-P2/STR)。经PCR鉴定后进行大量扩增和纯化,采用PCR、荧光显微术鉴定目的基因的表达,并测定病毒感染滴度。2. Ad5-GGC-hSSTr2a-IRES-EGFP在人乳腺癌MCF-7细胞内的表达。以MOI = 50的重组腺病毒(Ad5-P1/STR, Ad5-P2/STR)感染人乳腺癌细胞MCF-7后,分别在24h、48h、72h和96h采用荧光显微术与流式细胞术检测细胞内EGFP的表达。研究99mTc-HYNIC-TOCA与受感染MCF-7细胞的体外受体结合特性。并利用99mTc-GH放射性摄取实验研究GGC肽在MCF-7细胞的表达。3. Ad5-GGC-hSSTr2a-IRES-EGFP在荷瘤裸鼠体内的报告基因显像。建立荷人乳腺癌裸鼠模型(双侧上肢荷瘤),以重组腺病毒Ad5-P1/STR、Ad5-P2/STR、Ad5-EGFP及Ad5-TIS(Ad5-HSV1-TK-IRES-hSSTr2a)对照性注射于两侧瘤体内(1×109IU),于感染48h后分别进行以99mTc-GH和99mTc-HYNIC-TOCA为显像剂的核素报告基因SPECT显像以及GFP活体荧光显像。同时以1×108～3×109 IU梯度滴度的重组腺病毒分组感染两侧瘤体,48小时后进行核素报告基因SPECT显像。通过感兴趣区(region of interest, ROI)技术进行半定量分析,计算肿瘤/非肿瘤比值(T/NT)。显像完毕后进行生物学分布实验,测定离体肿瘤标本的放射性计数,计算显像剂在裸鼠体内各脏器及肿瘤组织的克组织百分摄取率(%ID/g)。分别取感染Ad5-P1/STR和Ad5-P2/STR两侧肿瘤组织固定保存,以免疫组织化学技术检测病毒感染后肿瘤组织内hSSTr2a蛋白的表达。结果:1.重组腺病毒载体Ad5-GGC-hSSTr2a-IRES-EGFP的构建与表达鉴定。重组腺病毒载体Ad5-GGC-hSSTr2a-IRES-EGFP(Ad5-P1/STR,Ad5-P2/STR)构建正确,PCR可特异性扩增出hSSTr2a片段(1212bp),荧光显微镜下显示出绿色荧光蛋白EGFP (enhanced green fluorescent protein)的表达。测得Ad5-P1/STR和Ad5-P2/STR的TCID50值均为8.2×109/mL。2. Ad5-GGC-hSSTr2a-IRES-EGFP在人乳腺癌MCF-7细胞内的表达。重组腺病毒以MOI=50感染MCF-7后,细胞内EGFP的表达随时间的延长而逐渐增强,至感染后48h,显微镜下绿色荧光最强且集中,流式细胞术检测其EGFP表达率为99.6%。72h后荧光逐渐减弱,流式细胞术检测EGFP表达率亦逐渐减低。以MOI=50的重组腺病毒感染后,MCF-7细胞对99mTc-GH的摄取率随时间延迟而逐渐增高,30min后重组腺病毒感染组与Ad5-EGFP感染的对照组细胞的摄取率有显著性差异( Ad5-P1/STR vs Ad5-EGFP : t=4.267~39.728 , Ad5-P2/STR vs Ad5-EGFP :t=4.362~9.455 , P均<0.01 )。而Ad5-P1/STR组与Ad5-P2/STR组无显著性差异(Ad5-P1/STR vs Ad5-P2/STR:t=0.347~1.083,P>0.05)。以MOI=0～100的重组腺病毒感染MCF-7后,细胞对99mTc-GH的摄取率均随感染滴度的增加而逐渐增加,且细胞对99mTc-GH的摄取率与Ad-P1/STR或Ad-P2/STR的感染滴度之间存在良好的相关性,R2分别为0.8997和0.9242 (P均<0.01)。3. Ad5-GGC-hSSTr2a-IRES-EGFP在荷瘤裸鼠体内的报告基因显像。活体GFP荧光显像可见,感染Ad5-P1/STR、Ad5-P2/STR和Ad5-EGFP的肿瘤部位均可见绿色荧光,而感染Ad5-TIS的肿瘤部位未见绿色荧光。体内放射性核素显像可见,感染重组腺病毒Ad5-P1/STR和Ad5-P2/STR的肿瘤部位可被99mTc-GH显像,而感染Ad5-EGFP的肿瘤部位无明显显像剂浓聚,其5h的T/NT比值有显著性差异(tP1, EGFP=4.780, tP2, EGFP=8.981, P均<0.05)。感染Ad5-P1, P2/STR的肿瘤部位在99mTc-GH显像与99mTc-HYNIC-TOCA显像中均可见显影,而感染Ad5-TIS的肿瘤部位仅在99mTc-HYNIC-TOCA显像中显影。以不同滴度的重组腺病毒感染肿瘤后显像提示,肿瘤组织对显像剂的摄取随感染滴度的增高而逐渐增加,且平均% ID/g值与Ad5-P1/STR或Ad5-P2/STR感染滴度的对数值呈线性相关(相关系数R2分别为0.8458和0.8948,P均<0.05)。而感染Ad5-P1/STR和Ad5-P2/STR的两组肿瘤的平均% ID/g值之间无显著性差异(t=0.039~2.314,P均>0.05)。免疫组织化学检测显示,感染Ad5-P1/STR和Ad5-P2/STR的肿瘤组织内均可检测到hSSTr2a的表达。结论:含有GGC肽和hSSTr2a基因序列的融合受体重组腺病毒载体Ad5-P1/STR和Ad5-P2/STR构建成功。重组腺病毒感染荷瘤裸鼠后,GGC肽在其体内的表达可被核素显像所显示,肿瘤组织对显像剂的摄取与病毒感染滴度具有良好的相关性。GGC序列有望作为新型报告基因用于核素报告基因显像。