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甲醛作为一种原生毒素,对生物体有很强的毒害作用,是室内空气污染的主要污染物之一。如何有效的控制空气中的甲醛污染,已引起人们的高度关注。通过生物法降解甲醛将成为去除甲醛的有利手段。本文合成了乳酸乳球菌偏爱密码子优化的甲醛脱氢酶的基因,并以乳酸乳球菌(L.lactis)为宿主,构建可以表达FADH的基因工程菌L6,并对其表达产物进行了鉴定和初步应用研究。Sphingomonas sp.ACM-3962的甲醛脱氢酶FADH由336个氨基酸残基组成。乳酸乳球菌偏爱GC含量降低的编码密码子,根据Lactococcus lactis subsp.cremoris SK11的2504个编码区、696252个密码子的使用情况统计,选择了丰沛及偏爱密码子进行优化。共替换了246个密码子。密码子优化后,可使FADH在乳酸乳球菌中个表达量提高37.14%。鞘氨醇单胞菌ACM-3962的HOCO降解基因簇,在FADHC和FADHA基因之间,存在着一个正向启动子和一个反向启动子,分别控制着FADHA和FADHC的表达。将该段序列克隆出来,在其上下游分别添加绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白,克隆到大肠杆菌中,检测并验证其功能。实验结果表明,FADH promoter的正向启动子,可以启动FADHA基因表达的启动子,可以在HOCO的诱导下启动,使其下游的蛋白得以表达。将FADH promoter-GFP基因和合成的FADH基因插入到pMG36e载体中,构建重组载体pMG-FADH。在E.coli BL21中扩增、验证后,电击转化进L.lactis ML23中,构建可以表达FADH的基因工程菌L.lactis L6。将培养液放置在有紫外灯照射的暗室中,观察菌液颜色,可见菌液发出绿色荧光,表明在HOCO存在时,FADH promoter可以启动GFP-FADH融合的表达,使L.lactis ML23的菌液在紫外灯下发出绿色荧光。实验结果表明,FADH promoter的正向启动子,在乳酸乳杆菌中也可以启动GFP-FADH融合蛋白的表达。冻干的纯化FADH粉末,在加入含有HOCO的水溶液中后,可以在3h内将97%以上的HOCO水解成线性分子,大大降低HOCO的毒性。与未冻干的FADH相比,冻干酶活损失了超过34.8%,因此表达纯化后的FADH的应用受到较大限制。冻干的纯化乳酸乳球菌粉末,在加入含有HOCO的水溶液中后,可以在3h内将99%以上的HOCO水解成线性分子,大大降低HOCO的毒性。与未冻干的FADH乳酸乳球菌,冻干酶活损失了30%,菌体死亡数量大约为48%,因此将乳酸乳球菌直接冻干使用具有较好的应用前景。使用冻干的乳酸乳球菌进行自然水体的HOCO降解,与实验室buffer条件下相比,其酶活大大降低,这是因为自然水体中营养物质匮乏、pH等条件较苛刻造成的。这也表明,利用冻干的乳酸乳球菌进行自然水体的HOCO降解,还需进行深入研究。在空气中含有100PPM的甲醛时,可诱导乳酸乳球菌中的绿色荧光蛋白进行表达,其荧光强度与菌体量呈线性关系。空气中含有20ppm的甲醛时,绿色荧光蛋白就开始表达,60ppm以上时,绿色荧光强度可定量检测。制备的滤纸片甲醛检测生物传感器,可对环境中的甲醛进行响应,在紫外灯下观察到明显的绿色荧光。构建的乳酸乳球菌基因工程菌,可以对空气环境中甲醛进行响应,从而起到检测空气中甲醛的作用,可以作为空气中甲醛检测生物传感器使用。