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研究背景宫颈癌(Uterine cervical cancer, UCC)是妇科常见恶性肿瘤之一,全球每年新增病例49.3万例,死亡病例27.4万例。虽然由于细胞学筛查策略的广泛应用,UCC的发病率有明显下降,但其仍未女性第二大高发恶性肿瘤。近年来随着UCC发病明显趋于年轻化以及宫颈腺癌发生比例的明显增加,对UCC的诊治又提出了新的问题。因此,寻找一种科学、可行的途径来提高加对UCC的早期诊断和预后判断,从而实现对UCC的早期发现,早期治疗,已成为当前研究的热点问题。目前认为高危型人乳头瘤病毒(Human papillomavirus, HPV)的感染是导致UCC发生主要的因素,流行病学资料显示高危型HPV DNA在UCC中的检出率达95%～100%。然而,在感染高危型HPV的妇女中,只有少数发展为UCC,提示可能还有其他因素参与肿瘤的发生。B细胞特异性莫洛尼氏白血病毒插入位点1(B cell-specific MLV integrationsite-1, Bmi-1)基因是PcG基因家族的重要成员(PcG),于1991年由荷兰癌症中心作为一种原癌基因与另一种癌基因c-myc共同导致B细胞非霍奇金淋巴瘤的发病而发现的。Bmi-1通过抑制p16Ink4a和p14Arf两种抑癌蛋白的表达,能够抑制p53和pRB生长调节途径诱导的凋亡和衰老。并且,Bmi-1能够激活端粒酶逆转录基因(hTERT),从而能够延长生命复制周期,使细胞发生无限增殖。最近,Bmi-1发现在血液恶性肿瘤和部分实体瘤中呈过表达。由此可见,Bmi-1在肿瘤的发生、发展中发挥着重要作用。然而目前有关Bmi-1在UCC中的表达情况以及Bmi-1在UCC发生、发展中的作用研究国内外报道较少。基于此,本研究目的是对Bmi-1在UCC组织和外周血中的表达进行检测,并通过RNAi技术抑制UCC细胞系中Bmi-1基因的表达,观察Bmi-1在UCC组织和外周血中的表达情况及其对细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响,探讨Bmi-1在UCC早期诊断和预后判断中的价值及Bmi-1在UCC发生发展、侵袭转移等过程中的作用机制,为寻找UCC诊断及治疗新靶点提供依据。第一部分Bmi-1蛋白在宫颈癌组织中的表达及其与临床病理特征和预后的关系目的：观察Bmi-1在宫颈癌(UCC)中的表达情况,探讨Bmi-1与UCC临床病理特征和预后的关系。方法：采用Western blot方法检测Bmi-1在宫颈正常上皮细胞(NCEC)和四种UCC细胞系(Hela, SiHa, CasKi和C33A)中的表达。利用免疫组织化学方法检测152例UCC和30例癌旁正常石蜡包埋组织中的Bmi-1表达情况。结果：Western blot分析显示,Bmi-1在四种人UCC细胞系(Hela, SiHa, CasKi和C33A)中过表达,而在NCEC中呈弱表达。在152例UCC石蜡包埋组织切片中,Bmi-1在27例中呈阴性表达(-),29例中呈弱阳性表达(+),55例中呈中度表达(++)和41例中呈强表达(+++)。Bmi-1在UCC组织中的过表达率为63.2%(Bmi-1++或+++)。然而,在30例癌旁正常对照组织中,Bmi-1只发现阴性或弱阳性表达。Bmi-1的过表达率与肿瘤大小(P=0.046)、临床分期(P=0.021)和局部淋巴结转移(P=0.010)密切相关,而与患者年龄(P=0.645)、间质浸润深度(P=0.428)、组织类型(P=0.367)和细胞分化程度(P=0.247)无关。生存曲线分析显示,Bmi-1的过表达与患者差的整体生存期(OS)明显相关(P=0.021)。Cox比例风险模型分析显示,Bmi-1过表达是OS的独立预后因素。结论：Bmi-1在UCC中过表达,并且与UCC负面临床特征和预后不良相关,提示Bmi-1参与了UCC的发生、发展过程,其可以作为恶性表型和预后不良的一项预测指标。第二部分血浆循环Bmi-1mRNA的检测及其对宫颈癌诊断和预后价值的评价目的：评估血浆循环Bmi-1mRNA对宫颈癌(UCC)的潜在诊断和预后价值。方法：采用实时荧光定量PCR方法检测109例UCC患者、138例宫颈上皮内瘤变患者(CIN)和80例健康对照者血浆中循环Bmi-1mRNA水平。采用受试者工作曲线分析循环Bmi-1mRNA对UCC的诊断效能。采用Cox比例风险模型分析Bmi-1mRNA对UCC的预后价值。结果：GAPDH和EEF1A1mRNAs在247例(91.8%)宫颈病变患者和80例(94.1%)健康对照者中检测到,两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。UCC组血浆循环Bmi-1mRNA的中位水平明显高于CIN各组和健康对照组(P均<0.001)。CIN2组、C1N3组血浆循环Bmi-1mRNA的中位水平明显高于CIN1组、CIN2组和健康对照组(P均<0.05)。UCC组血浆SCC、CA125的中位水平明显高于CIN3组、CIN2组、CIN1组和健康对照组(P均<0.01)。血浆循环Bmi-1mRNA水平与UCC患者临床分期(P<0.001)和淋巴结转移相关(P=0.002)。循环Bmi-1mRNA诊断UCC的ROC曲线下面积(AUC)为0.881,最佳临界值为0.057,诊断敏感性为69.7%,特异性为95.9%。SCC-Ag和CA125诊断UCC的敏感性分别为56.0%和33.9%。循环Bmi-1mRNA对UCC的诊断效能明显高于SCC-Ag(0.740,95%CI=0.689～0.787,P=0.035)和CA125(0.689,95%CI=0.636～0.739, P<0.001)单独检测。Kaplan-Meier曲线分析显示,高水平的循环Bmi-1mRNA与较低的无病生存期(DFS)(P=0.001)和整体生存期(OS)(P=0.015)明显相关。Cox比例风险模型分析显示,循环Bmi-1mRNA是DFS和OS的独立预后因素。结论：循环Bmi-1mRNA水平在UCC血浆中明显升高,并且与患者负面临床病理特征和预后不良相关。循环Bmi-1mRNA可以作为UCC诊断和预后判断的一项潜在的无创性指标。第三部分Bmi-1对宫颈癌SiHa细胞的生物学效应研究目的：通过siRNA干扰宫颈癌(UCC)SiHa细胞中Bmi-1的表达,分析沉默Bmi-1的表达对SiHa细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响,进一步分析Bmi-1在UCC发生、发展中的作用。方法：根据Bmi-1基因序列,设计合成干扰Bmi-1的四条siRNA序列(siRNA-1、 siRNA-2、siRNA-3和siRNA-4),分别转染SiHa细胞,同时设立阴性对照组(转染阴性对照siRNA, NC组)、转染试剂对照组(加入与实验组等量的转染试剂,Mock组)和空白对照组(对细胞不做任何处理,Blank组)。RT-qPCR方法检测转染后SiHa细胞中Bmi-1mRNA的表达,应用CCK8实验、Annexin V-FITC/PI双标记实验和Transwell实验分析转染后细胞的增殖、凋亡及侵袭能力的变化。结果：siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3、siRNA-4组转染SiHa细胞24h、48h后Bmi-1mRNA水平较NC组、Mock组和Blank组明显降低(P<0.05),其中siRNA-4组的Bmi-1mRNA下降最为明显。与NC组、Mock组、Blank组比较,siRNA-4转染组细胞在24、48、72h、96h4个时段里生长速度明显减缓,差异均有统计学意义(P<0.05)。siRNA转染SiHa细胞48h后,siRNA-4组的凋亡率为(62.43±9.86)%,明显高于NC组的(10.17±5.15)%、Mock组的(8.56±4.27)%和Blank组的(8.12±3.89)%,差异均有统计学意义(P<0.05)。侵袭试验中,siRNA-4组的穿膜细胞数为(253.29±68.72)明显少于NC组(350.21±98.62)、Mock组(406.38±113.51)和Blank组(418.46±119.78)。结论：siRNA可特异性抑制SiHa细胞中Bmi-1基因的表达,从而抑制肿瘤细胞的增殖,诱导细胞发生凋亡,减弱其侵袭能力,进一步证实Bmi-1在UCC中的作用,同时该研究也为应用RNAi进行UCC的基因治疗提供了实验依据。