研究背景：促甲状腺激素(TSH)是由腺垂体分泌的一种激素,调节甲状腺生长和分化。然而,近来研究发现TSH不仅是一种促激素,而且还对代谢具有多重影响,如胆固醇合成和糖代谢。大量流行病学研究证实TSH与总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇正相关。亚临床甲减(Subclinical hypothyroidism, SCH)的特征是甲状腺激素水平正常但TSH水平升高,往往伴随着高胆固醇血症,与心血管疾病密切相关。由此,许多研究正通过关注TSH与高胆固醇血症的关系,去探索防治心血管疾病新的方法。肝脏是负责胆固醇代谢的主要器官,固醇调节元件结合蛋白2 (Sterol regulatory element-binding protein-2, SREBP-2)在内质网以前体形式合成,然后经历一个顺序裂解过程成为一个包含氮端转录活性形式,活性形式转位进入核内促进肝脏胆固醇合成与吸收靶基因的表达,如3-羟基3-甲基戊二酰辅酶A合成酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase, HMGCS)、低密度脂蛋白胆固醇受体(low-density lipoprotein receptor, LDLR)、3-羟基3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase, HMGCR).肝脏特异性表达SREBP-2转基因小鼠中总体胆固醇合成增加,伴随着HMGCS mRNA增加了13倍、HMGCR75倍、LDLR5.8倍。另外,我们先前的研究证实TSH能够通过cAMP/PKA/CREB通路上调肝脏胆固醇合成限速酶HMGCR的表达。而且,MinHK等研究发现在非酒精性脂肪肝中大量游离胆固醇、甘油三酯聚集,伴随着AMPK活性降低和SREBP-2、HMGCR表达增加。近来,有证据显示TSH水平与非酒精性脂肪肝密切相关。因此,这些发现暗示TSH在肝脂肪变性和血脂异常中的可能作用。我们发现TSH在肝细胞中可增加SREBP-2的表达,尽管具体分子通路尚不清楚。腺苷酸激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)是关键的细胞能量感受器,在各种代谢应激情况下其a亚单位的第172苏氨酸位点磷酸后可被激活,AMPK成为糖脂代谢的主要调节者,是通过磷酸化作用失活许多参与代谢的酶包括糖原合成酶,乙酰辅酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase, ACC), HMGCR,环磷酸腺苷反应元件结合蛋白调节转录共激活因子2 (cAMP-response element binding protein regulated transcriptional co-activator2, CRTC2)等发挥作用。近来,AMPK显示可成为一个在治疗代谢疾病非常有吸引力的药物干预靶点。在肝脏特异性过表达AMPKα1小鼠中,AMPK’慢性激活导致代偿性的SREBP-2和HMGCR表达增加,而在脂肪组织中SREBP-2和HMGCR的mRNA水平是下调的。一项近来的研究显示AMPK直接作用并磷酸化SREBP-1、SREBP-2,通过阻碍蛋白裂解成熟和核内转位来抑制SREBP活性。但是,TSH、AMPK、SREBP-2三者之间是否有直接联系尚不清楚。目的：我们的目的是研究AMPK在肝脏中是否可通过SREBP-2在调节肝脏胆固醇代谢中起到积极作用,以及是否AMPK对TSH介导的SREBP-2的上调具有影响,这也许可为将来临床治疗与TSH相关的高胆固醇血症提供依据。研究方法：1.体外实验：在HepG2细胞中,用AMPK激动剂AICAR、TSH分别处理细胞,用SAMS试验检测AMPK活性变化,观察SREBP-2胞浆前体及核内活性形式及其靶基因HMGCR, HMGCS的表达变化。2.体内试验：采用野生型(Tshr+/+)和TSH受体敲除(Tshr/-)小鼠,AMPK激动剂AICAR腹腔注射Tshr+/+和Tshr-/-小鼠,观察胞浆及核内成熟体SREBP-2及其靶基因HMGCR、HMGCS的表达变化。3.用AMPK激动剂AICAR处理HepG2细胞,2xFlag-SREBP-2质粒瞬时转染表达SREBP-2核内活性形式,免疫沉淀SREBP-2、免疫印迹丝氨酸或苏氨酸磷酸化抗体验证AMPK可磷酸化SREBP-2核内活性形式。4.在AMPK激动剂AICAR处理HepG2、L02细胞、Tshr-/-、Tshr+/+小鼠,肝细胞总蛋白免疫沉淀SREBP-2、免疫印迹丝氨酸或苏氨酸磷酸化抗体验证AMPK可磷酸化SREBP-2胞浆前体形式。5.双重免疫荧光染色法验证TSH对AMPK磷酸化SREBP-2的抑制作用。6.主要技术：Real-Time PCR、免疫沉淀、免疫印迹、免疫荧光、质粒瞬时转染及建立小鼠试验模型等。结果：1.TSH在HepG2细胞上调SREBP-2蛋白水平和HMGCR、HMGCS的表达。SREBP-2在肝脏优先调节负责胆固醇合成与吸收的靶基因如HMGCR、 HMGCS,在给予TSH(4μM)处理HepG2细胞,SREBP-2前体及核内活性形式被发现呈时间依赖方式增加。TSH处理后HMGCR的mRNA在24小时和48小时均上调,HMGCS的mRNA在48小时上调(p<0.05)。2.HepG2细胞AICAR激活AMPK可直接抑制SREBP-2的表达。SREBP-2可在多个水平被调控如固醇反馈机制或转录水平、翻译后修饰等多个方面,曾有证据表明SREBP-2是AMPK的一个直接靶点,AMPK可直接抑制SREBP-2的转录活性。为了探讨AMPK激活后是否对SREBP-2的前体和核内形式具有调节作用,HepG2细胞给予AMPK的激动剂AICAR处理12小时和24小时,作为AMPK激活的标志,磷酸化AMPK和磷酸化ACC水平明显增加并且呈时间依赖性,SREBP-2前体在AICAR孵育12小时有一个轻度减少,而在处理24小时跟随着出现一个明显减少,.但是SREBP-2的核内形式在整个处理期间呈现一个明显连续减少。为证实这种变化,我们用实时PCR监测SREBP-2的mRNA水平,AICAR诱导激活的AMPK以时间依赖方式减少了SREBP-2的mRNA水平。在AICAR处理HepG2细胞,核内SREBP-2的免疫荧光强度明显降低。3. AICAR处理的Tshr+/+ and Tshr-/-小鼠肝脏中,AMPK激活可减少SREBP-2蛋白及其靶基因表达。早先曾有报道在甲状腺及肝脏中TSH能够抑制AMPK活性。为了进一步研究TSH和AMPK对SREBP-2的影响,我们建立Tshr+/+ and Tshr-/-小鼠模型,与Tshr+/+小鼠相比,Tshr-/-小鼠肝脏中SREBP-2前体及核内形式均减少了,尽管确切机制尚不清楚。HMGCR的mRNA水平也明显减少,HMGCS的mRNA呈现一个减少趋势。在PBS处理的Tshr-/-小鼠相较于Tshr+/+小鼠,小鼠肝脏中AMPK活性增加,而且,Tshr-/-小鼠肝脏中SREBP-2的前体及核内蛋白均明显减少。在AICAR处理的Tsh-/-和Tshr+/+小鼠的肝脏,AMPK活性增强,SREBP-2蛋白水平降低。AICAR导致一个HMGCR mRNA明显降低。4. HepG2细胞AICAR激活AMPK可抑制TSH诱导的SREBP-2的上调。为了进一步验证TSH对AMPK活性的影响,在体外我们采用SAMS多肽磷酸化试验,HepG2细胞给予TSH处理后,AMPK活性明显降低,而AICAR处理HepG2细胞后,AMPK活性明显增强。下一步我们研究TSH诱导的SREBP-2上调是否通过AMPK激活,我们发现TSH诱导上调的SREBP-2的前体及核内形式可被AICAR减轻。为了明确AMPK激活抑制SREBP-2后的功能结果,用实时PCR评价SREBP-2的靶蛋白酶的转录水平变化,同动态变化的SREBP-2蛋白一致,在HepG2细胞中TSH刺激升高的HMGCR和HMGCS的mRNA水平被AICAR减弱。5.在AICAR诱导AMPK激活的细胞及小鼠肝脏中,SREBP-2的苏氨酸位点可被磷酸化。AMPK作为一个进化的保守的丝氨酸／苏氨酸激酶,在调节关键代谢过程中具有重要作用,可磷酸化多种涉及脂肪酸氧化、胆固醇合成过程中间酶激活或者抑制这些酶的活性。近来研究证实在HEK293细胞和LDLR敲除小鼠肝脏中,SREBP-2是AMPK的直接靶点。为了研究AMPK是否涉及到SREBP-2的磷酸化修饰,我们利用特异性苏氨酸磷酸化抗体和丝氨酸磷酸化抗体,首先SREBP-2抗体免疫沉淀总蛋白,使用苏氨酸磷酸化抗体和丝氨酸磷酸化抗体进行免疫印迹分析,显示SREBP-2的前体和核内形式均有苏氨酸位点磷酸化,SREBP-2无丝氨酸位点磷酸化。我们已经显示在Tshr-/--小鼠较Tshr+/+小鼠AMPK活性增强,同前述的结果一致,在Tshr-/-小鼠中内源性SREBP-2前体苏氨酸磷酸化的水平增加。在人肝L02细胞中也得到相似结果。6. AMPK磷酸化SREBP-2,而TSH可抑制AMPK对SREBP-2的磷酸化。结论：1.AMPK在肝脏可抑制TSH介导的对SREBP-2及其靶基因HMGCR、 HMGCS的上调作用。2. AMPK可直接磷酸化SREBP-2前体及核内活性形式的苏氨酸位点。3.TSH与AMPK相互作用影响SREBP-2的磷酸化进而调节SREBP-2活性。