Duchenne型肌营养不良症(DuchenneMuscularDystrophy,DMD)是一种X连锁隐性遗传病，临床特征为进行性四肢近端骨骼肌萎缩无力、小腿腓肠肌假性肥大，一般3-5岁起病，病情进行性进展，12岁左右丧央行走能力，多于20岁左右死于呼吸衰竭和/或心力衰竭。其病因是由于X染色体的抗肌萎缩蛋白基因突变，导致其编码的细胞骨架蛋白dystrophin缺乏。Becker型进行性肌营养不良(Beckermusculardystrophy，BMD)临床表现与DMD相似但病情较轻，15岁以上仍保持行走能力。DMD和BMD虽均由同一基因突变所致但临床表型差别较大，DMD被认为是致死性的而BMD则相对良性，生存期较长，生活质量较高。 DMD/BMD的致病基因被定位于X染色体短臂2区1带(Xp21)，于1987年通过反向遗传学的方法克隆成功，长度大约为2.4Mb，是目前为止发现的人类最大的基因之一，占整个X染色体的2％及人类基因组的0.05％。该基因90％的序列为内含子，其cDNA全长14kb，共有79个外显子，编码的蛋白产物被命名为dystrophin，即抗肌萎缩蛋白。 DMD基因突变率为1/10000，远高于其他基因的突变率。突变形式有多种，其中缺失占60-65％，重复占5-10％，其余30-35％可能是点突变或为常规方法检测不到的基因片段缺失或重复。DMD基因的缺失分布存在两个热点区，分别位于5’氨基端和中央区，前者累及外显子3～19占总缺失的20％左右，后者累及外显子44～53占总缺失的70％左右。Monaco于1988年提出了阅读框原则，认为若基因缺失或重复突变打破了阅读框或造成阅读框移码，致使dystrophin表达严重障碍，则产生典型的DMD；若基因突变时邻近的外显子能保持阅读框不变而尚有部分dystrophin表达，则临床症状较轻表现为BMD。我国学者张成等通过对65例整码缺失DMD患者的研究发现，dystrophin蛋白存在4个疏水肽段，其中第3个肽段的疏水性最强，由51号外显子编码。75％的DMD这个疏水肽段消失，98％的BMD缺失不累及这个疏水肽段，提出若整码缺失累及了缺失热区肽段，则基本是DMD。Dystrophin的绞链3区对维持dystrophin的弹性、柔韧性及维护细胞膜的稳定性方面有重要的作用，所以该区域的破坏将导致严重的临床表型。但以上理论尚未解决DMD整码缺失造成抗肌萎缩蛋白的结构缩短后如何影响其空间结构导致DMD发生的机制。因此，弄清一级结构改变后抗肌萎缩蛋白空间结构的变化，对于阐明抗肌萎缩蛋白的重要结构功能区和DMD发病机制有重要意义。 本实验的目的是通过研究dystrophin基因外显子缺失类型、缺失前后蛋白质疏水性质改变和空间结构异常与临床表型的关系，初步探讨缺失后蛋白空间结构功能改变对临床表型的影响及可能的发病机制。 材料和方法一病例资料收集整理本院2002年至2005年104例确诊DMD/BMD患者的基因检测结果，并利用其中59例缺失型突变的DMD/BMD患者临床和基因检测资料分析基因缺失类型和临床表型的关系。 二ORFFinder程序预测抗肌萎缩蛋白的一级结构利用信息生物学的数据库搜索，生物软件分析等方法完成dystropin蛋白关键区段的分析，通过ORFFinder程序预测dystrophin基因外显子缺失前后dystrophin蛋白的一级结构，用Bioedit软件作突变前后序列比较分析以对比基因突变后dystrophin一级结构的改变。 三Bioedit软件分析抗肌萎缩蛋白的疏水性由于移码突变时终止密码提前出现致使翻译提前终止，影响到dystrophin的重要功能区如富含半胱氨酸区和羧基端，所以根据移码突变不易分析dystrophin的关键区段，因此本实验将用Bioedit软件对本组整码突变后的dystrophin蛋白作Kyte&Doolittle平均疏水轮廓分析，研究突变后蛋白疏水区段改变与临床表型的关系。 四SWISS-MODEL同源模构法模建并分析抗肌萎缩蛋白的功能区Dystrophin蛋白是一个有3685个氨基酸的巨大蛋白，由于模板的限制，目前同源模构方法不可能构建整个dystrophin蛋白的三维模型，所以本实验将尝试使用SWISS-MODEL服务器构建dystrophin的3个重要功能区：氨基端、第三铰链区、富含半胱氨酸区的三维模型。将dystrophin的氨基酸序列提交到SWISS-MODEL服务器后，服务器即在ExPdb晶体图像数据库中进行相似性搜索。搜索结果显示有三个最佳对比区域，网站用“Batch”表示这些最佳对比区域，分别位于序列的第4～251位氨基酸残基(Batch2)、2470～2585位氨基酸残基(Batch3)、3042～3311位氨基酸残基(Batchl)，对应的是dystrophin蛋白氨基端及与之相连的中央区的前10个氨基酸、第三铰链区的大部分、富含半胱氨酸区及与之紧接的羧基端前部的11个氨基酸，服务器将为这些区域建模。所以Batchl、Batch2、Batch3将看作是富含半胱氨酸区、氨基端、第三铰链区三维模型。然后用生物软件和数据库搜索对比等方法分析这三个模型。 结果一DMD基因突变类型104例确诊DMD/BMD患者中缺失型59例(56.8％)，重复型12例(11.5％)，未检出缺失或重复(可能是点突变或其它形式突变)33例(31.7％)。59例缺失型突变主要分布在5′端缺失热区外显子3～11区域占总缺失的20.2％和中央缺失热区外显子44～54占总缺失的58.1％，51号外显子缺失频率最高(8.7％)。59例缺失型突变中共有50例移码突变，9例整码突变，移码突变均为DMD，4例BMD患者均为整码突变。 二整码缺失及疏水性9例整码突变中累及第三疏水峰的5例，4例为DMD(均为51～52号外显子缺失)，1例BMD(45～53号外显子缺失)。 三3号外显子缺失抗肌萎缩蛋白空间结构的改变3号外显子缺失后dystrophin的氨基端三维模型变化不大但空间位置发生扭转。Pafm数据库同源性搜索显示3号外显子缺失后，dystrophin蛋白的氨基端的第一个Calponin同源区即CH1区(Calponinhomologydomain)的命中指数(Score)由108下降至36.5，期望值(Evalue)由2.3e-29升高至8.1e-08，其余结构区完整。从dystrophin肌动蛋白结合区域晶体模型分析，3号外显子缺失后肌动蛋白结合区域的CH1区C螺旋缺失。 结论1肌营养不良的临床表型轻重与外显子的缺失数目不呈平衡关系，与缺失是否破坏阅读框有关。整码突变累及第三疏水峰临床表型多为DMD。 2WW区、富含半胱氨酸区和羧基端区是dystrophin的重要结构区域，直接或间接累及这些区域的突变临床表现为DMD。 3蛋白的空间结构改变决定其临床表型的轻重，移码突变后蛋白空间结构改变大甚至不能合成dystrophin，临床表现为DMD，整码突变对蛋白的空间结构影响较移码突变小，临床表现为BMD。 43号外显子缺失后蛋白的氨基端空间位置可能发生扭转，氨基端肌动蛋白结合区域的CH1区螺旋区C缺失，影响了dystrophin与肌动蛋白的结合功能，但其他主要功能区功能仍存在，临床表现为BMD。 5与传统的基于实验室的生物学方法相比，生物信息学的方法可以用较低的成本和较快的时间获得比较可靠的结果。但很多问题还需要通过实验室验证。