第一部分鼠伤寒沙门菌质粒对细菌生物膜形成的影响　　目的：　　鼠伤寒沙门菌（Salmonella typhimurium，S.typhimurium）在多种物体表面形成的生物膜（Biofilm，BF）对增强其致病性有重要作用。本研究探讨鼠伤寒沙门菌SR-11携带的100kb质粒对细菌在不同材质表面BF形成的影响，为后续进一步探讨该质粒的致病机制及抗菌药物的研制提供理论和实验依据。　　方法：　　1.BF形成适宜培养基的选择　　以携带质粒的鼠伤寒沙门菌野生株SR-11为受试菌，将对数生长期菌液分别接种于含肉汤培养基（Luria-Bertani，LB）和胰蛋白胨大豆肉汤培养基（Tryptose Soya Broth，TSB）的聚苯乙烯96孔培养板及置小圆玻片于底部的24孔培养板，30℃培养6h、12h、24 h和48h后用结晶紫半定量法比较在聚苯乙烯培养板与玻片表面BF形成的适宜培养基。　　2.带有绿色荧光蛋白GFP菌株的构建及生长曲线的测定　　参照文献将GFP基因导入携带100kb质粒的鼠伤寒沙门菌野生株SR-11和将该质粒消除后的突变株，构建带有绿色荧光蛋白GFP标记的发光菌。将对数生长期菌液稀释后涂布于含100μg/ml氨苄青霉素（Ampicillin，Amp）的LB固体培养基上，荧光显微镜下观察。用构建的野生株与突变株单克隆分别接种于LB培养基后测定细菌生长曲线。　　3.鼠伤寒沙门菌质粒对细菌在不同材质表面BF形成的影响　　按上述条件，将野生株和突变株分别在聚苯乙烯培养板与玻片表面建立BF模型。结晶紫半定量法比较受试菌6h、12h、24h和48h在两种材质表面BF形成的差异；共聚焦激光扫描显微镜（Confocal laser scanning microscopy，CLSM）断层扫描，比较受试菌在玻片表面BF的形成。　　结果：　　1.BF形成适宜培养基的选择　　结晶紫半定量法结果显示，野生株在聚苯乙烯培养板和玻片两种材质表面用LB培养基各时间点的OD590值均高于TSB培养基，说明LB培养基更适宜BF的形成，在后续实验中即选择LB培养基。　　2.带有绿色荧光蛋白GFP菌株的构建及生长曲线的测定　　荧光显微镜检测结果显示，用Amp选择培养基能筛选出表达GFP的野生株与突变株。与未导入GFP基因的菌株相比，细菌生长曲线未受明显影响。　　3.鼠伤寒沙门菌质粒对细菌在不同材质表面BF形成的影响　　结晶紫半定量法结果显示，6h、12h、24h和48h聚苯乙烯培养板表面生长的野生株与突变株OD590值均未见统计学差异（P>0.05）；在玻片表面生长的野生株OD590值各时间点均高于突变株（P<0.01）；野生株和突变株更易在聚苯乙烯培养板表面形成BF。CLSM观察结果显示，30℃静态培养48h后，野生株在玻片表面可形成融合成片的菌膜，平均厚度和最大厚度分别是25μm与30μm；突变株仅形成稀疏的菌落，平均厚度和最大厚度分别为15μm与18μm。　　结论：　　鼠伤寒沙门菌SR-11携带的100kb质粒能促进宿主菌在玻片表面BF的形成，但对聚苯乙烯培养板表面BF的形成未见明显影响，说明BF的形成除与细菌的胞外黏附成份相关外还与其生成的材质表面结构相关。　　第二部分胞外DNA对沙门菌生物膜形成的影响及其机制研究　　目的：　　通过检测鼠伤寒沙门菌SR-11与伤寒沙门菌ST6生物膜（Biofilm，BF）胞外DNA（Extracellular DNA，eDNA）的含量及来源，研究其在细菌BF形成和维持BF结构稳定性中的作用，为后续防治沙门菌感染、抗菌药物和消毒剂的研制提供理论和实验依据。　　方法：　　1.BF中eDNA的检测　　(1)eDNA的分子量测定和定量分析　　将对数生长期的SR-11和ST6菌液接种于含LB肉汤的聚苯乙烯6孔板，30℃静态培养，于6h、12h、24h和48h用细胞刮刀收集BF样本，分别用蛋白酶K和纤维素酶消化提取eDNA，琼脂糖凝胶电泳法测定eDNA的分子量并用紫外分光光度计对eDNA进行定量分析。　　(2)CLSM观察eDNA在BF中的定位　　将对数生长期的SR-11与ST6菌液接种于含LB培养基的24孔板中，置小圆玻片于24孔板底部，30℃静态培养48 h。DDAO[7-hydroxy-9H-(1，3-dichloro-9，9-dimethylacridin)，DDAO]染色后用CLSM观察荧光颜色的变化以确定eDNA在BF中的定位。　　2.eDNA对细菌BF形成及三维结构的稳定作用　　(1)微量平板法　　将对数生长期的SR-11和ST6菌液接种至含LB培养基的聚苯乙烯96孔培养板中，同时加入终浓度为50μg/ml的DNase I，另设未加DNase I作阴性对照，30℃静态培养48h。结晶紫半定量法分别在6h、12h、24h和48h各时间点检测DNase I对BF形成的影响。　　将对数生长期的SR-11和ST6菌液接种至含LB培养基的聚苯乙烯96孔培养板中，并加入用前法提取的分别来自各菌的eDNA（终浓度5μg/ml），另设未加eDNA作阴性对照，30℃静态培养48h。结晶紫半定量法分别在6h、12h、24h和48h各时间点检测eDNA对BF形成的影响。　　将对数生长期的SR-11和ST6菌液接种至含LB液体培养基的聚苯乙烯96孔板中，30℃静态培养48h后加入50μg/ml DNase I，另设未加DNase I作阴性对照。用结晶紫半定量法检测DNase I对BF结构完整性的影响。　　(2)CLSM观察法　　将对数生长期的带有绿色荧光蛋白GFP标记的SR-11和ST6菌液分别接种于含LB培养基的24孔板中，置小圆玻片于24孔板底部，并加入50μg/ml DNase I，另设未加DNase I作阴性对照，30℃静态培养48h后CLSM观察DNase I对BF形成的影响。　　将对数生长期的带有GFP标记的SR-11和ST6菌液接种于含LB培养基的24孔板中，置小圆玻片于24孔板底部，30℃静态培养48h后加入50μg/ml DNase I，另设未加DNase I作阴性对照，CLSM观察DNase I对受试菌BF三维结构的稳定作用。　　(3)DNase I对BF中活菌数的影响　　将稀释至OD600为0.05的SR-11和ST6菌液接种于6孔板中。实验组加入50μg/ml DNase I，另设未加DNase I作阴性对照，30℃静态培养48h。分别将菌液和形成于管壁的菌膜用梯度稀释平板菌落计数法对游离状态和固着状态的细菌进行计数，观察DNase I对两种状态下细菌生长的影响。　　3.RAPD-PCR检测eDNA的来源　　用随机扩增多态DNA聚合酶链式反应（Random amplified polymorphic DNA PCR，RAPD-PCR）分析eDNA的来源。用酚氯仿法提取细菌基因组DNA，用两种引物（P1254：5’-CCGCAGCCAA-3’，23L：5’-CCGCAGCCAA-3’）分别对SR-11和ST6的eDNA与基因组DNA进行扩增，琼脂糖凝胶电泳分析eDNA来源。　　结果：　　1.BF中eDNA的检测　　（1）SR-11与ST6 BF中均含有eDNA，琼脂糖凝胶电泳显示其相对分子量均大于10.0kb。随时间延长，细菌BF中eDNA含量均逐渐增加，SR-11形成的BF中eDNA明显多于ST6（P<0.01）。　　（2）SR-11和ST6 BF培养48h用DDAO染色后，CLSM观察发现SR-11形成的BF中，在表达GFP的活菌和裂解的红色死菌轮廓中有成片的红色eDNA；ST6 BF中仅见稀疏散在的红色eDNA。　　2.eDNA对细菌BF形成及三维结构的稳定作用　　（1）结晶紫半定量法结果显示，用微量平板在培养受试菌时加入50μg/ml DNase I，SR-11和ST6培养12h后实验组形成的BF明显多于对照组（P<0.01）。在受试菌培养时加入5μg/ml的eDNA，SR-11和ST6培养12h后实验组形成的BF均明显少于对照组（P<0.01）。受试菌培养48h后加入50μg/ml DNase I，实验组与对照组未见明显差异（P>0.05）。　　（2）CLSM观察结果显示，受试菌培养液中加入50μg/ml DNase I，静态培养48h后在小圆玻片底部均能形成大片状密集的BF，铺满整个玻片底部；阴性对照组仅有稀疏散在的菌落。在细菌培养48h后加入50μg/ml DNase I，实验组与对照组未见明显差异。　　（3）受试菌培养液中加入50μg/ml DNase I静态培养48 h后，活菌计数结果显示，SR-11和ST6游离状态的细菌中两实验组和阴性对照组的活菌数未见明显差异（P>0.05），BF中固着状态的细菌中两实验组均明显多于阴性对照组（P<0.01）；　　3.RAPD-PCR检测eDNA的来源　　RAPD-PCR结果显示，SR-11和ST6的eDNA与细菌基因组DNA扩增片段基本相同，说明eDNA来源于细菌裂解后释放的基因组DNA。　　结论：　　鼠伤寒沙门菌SR-11和伤寒沙门菌ST6的BF胞外基质中存在eDNA，其分子量大于10.0kb，主要来源于细菌基因组DNA。鼠伤寒沙门菌SR-11和伤寒沙门菌ST6的eDNA能抑制细菌BF的形成，但对其三维结构的稳定未见明显影响。