黄酮类化合物是植物重要的次生代谢产物,其衍生物具有多种生理和健康功能。研究表明类黄酮化合物B环羟基化数目与其药理作用呈正相关。因此,本实验利用羟化酶复合物HpaBC优化了 B环邻位羟基黄酮类化合物合成的条件。本文构建了多种HpaBC表达载体,根据其活性差异筛选出P2和P2&3开展了发酵条件的优化,结果表明最优的培养条件为:底物（naringenin,N）浓度80 mg/L,菌株诱导温度28℃,最适培养基M9,底物延迟添加时间6 h。在最优的培养条件下,P2&3菌株最高可生产46.84±2.85 mg/L的圣草酚（eriodictyol,E）。本论文同时开展了HpaBC催化底物多样性的研究。在最优的培养条件下,P2&3菌株可将阿福豆素（Afzelechin,Af）和香豆酸（p-coumaric acid,p-CA）催化生成 29.81±2.66 mg/L 的儿茶素（catechin,C）和 28.91±1.77 mg/L 的咖啡酸（caffeic acid,CA）。另外,本文证实了 HpaBC 对二氢山奈酚（dihydrokaempferol,DHK）和山奈酚（kaempferol,K）的体内催化活性。本研究为在细菌表达系统中有效合成儿茶素、黄酮醇等B环二羟基黄酮类化合物提供了一条可行的途径。主要研究内容如下:1.大肠杆菌羟化酶HpaB和HpaC基因的克隆本文利用高保真PCR技术,克隆了大肠杆菌HpaB和HpaC基因。其中,HpaB基因长度为1563 bp,编码521的氨基酸;HpaC基因长度为513 bp,编码171个氨基酸。将HpaB和HpaC基因分别构建到pETDuet和pRSFDuet表达载体上,得到不同组合的质粒并转化E.coli BL21进行原核表达,SDS-PAGE检测结果显示,HpaB和HpaC基因可以在大肠杆菌BL21中表达。HpaB基因重组蛋白分子量为58.6 KDa,HpaC基因重组蛋白分子量为18.6 KDa。2.羟化酶复合体HpaBC系列表达载体的构建本文构建了 4 组重组质粒,分别为（P1）pRSFDuet-B-C,（P2）pRSFDuet-C-B,（P3）pETDuet-B-C,（P4）pETDuet-C-B,以及 2 组共表达质粒（P1&4）pRSFDuet-B-C 和 pETDuet-C-B,（P2&3）pRSFDuet-C-B 和 pETDuet-B-C。经 HPLC 结果分析表明,通过饲喂200 mg/L柚皮素N（B环一羟基黄烷酮）实现了圣草酚E（B环二羟基类黄酮）的生产。通过HPLC对圣草酚产量定量分析,筛选出催化活性较高的菌株P2和P2&3,为下一步条件优化的候选菌株。3.B-环二羟基类黄酮合成发酵条件的优化为了进一步提高B环二羟基类黄酮的产量,我们优化了诱导温度（20℃,28℃,37℃）,诱导时间（4 h,6 h,8 h）,初始底物浓度（分别为40 mg/L,60 mg/L,80 mg/L,100 mg/L,120 mg/L）以及培养基（TB 培养基,LB 培养基,M9 培养基）。通过条件优化得出P2&3菌株饲喂80 mg/L柚皮素时,在M9培养基中28℃诱导6个小时后,圣草酚的产量达到最高,可达46.84±2.85 mg/L,其对底物转化率为58%。4大肠杆菌羟基化复合体HpaBC底物多样性的检测利用优化发酵条件,我们分别检测了香豆酸p-coumaric acid（p-CA）,柚皮素（naringenin,N）,阿福豆素（Afzelechin,Af）,二氢山奈素（dihydrokaempferol,DHK）,山奈素（kaempferol,K）,天竺葵色素（pelargonidin,PEL）的催化活性。HPLC和HPLC-MS检测结果显示,羟基化复合体HpaBC具有p-CA催化生成咖啡酸（caffeic acid,CA）、Af催化生成儿茶素（catechin,C）、DHK催化生成二氢槲皮素（dihydroquercetin,DHQ）以及K催化生成槲皮素（quercetin,Q）的催化活性,然而未检测到花青素的催化活性。