以济宁青山羊为动物模型,从皮肤毛囊体外培养和遗传学角度阐明毛囊的生长发育规律、影响因素及其调控机制,不仅可为提高山羊绒品质的育种改良奠定基础;还可为提高羊毛品质、数量和毛皮花纹品质乃至医学领域的人类毛发研究等提供借鉴。毛囊体外培养技术的完善,皮肤成纤维细胞系和毛囊外根鞘细胞系的建立,可为研究毛囊生长与分化机制,尤其是白毛和黑毛纤维形成机制提供良好模型,也是研究相关细胞因子以及激素对毛囊发育、羊毛品质和黑色素形成与调控机理的基础。本研究在成功构建了济宁青山羊皮肤毛囊体外培养技术平台的基础上,筛选了最佳培养方法和培养体系,可为进一步深入研究毛囊分化与发育的影响因素和所涉及到的一系列生理现象,如皮肤毛囊细胞分化、真皮和表皮细胞间的互作等研究奠定基础。主要研究内容、方法和结果如下:一、山羊毛囊体外培养体系的优化通过比较不同培养温度(38.5℃、37℃和31℃)、不同培养基(无血清的Williams E培养基、无血清DMEM培养基和添加10%FBS的DMEM培养基)和培养液pH等,优化了山羊皮肤和毛囊的体外培养体系,结果发现:在无血清Williams E培养基,31℃培养温度、饱和湿度、95%空气和5%CO2的条件下毛囊生长状况最佳。二、细胞因子对毛囊体外培养的影响研究采用3因子3水平的正交试验设计原理,比较研究了添加不同质量浓度的类胰岛素生长因子(IGF-I)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、表皮生长因子(EGF)和催乳素(PRL)对毛囊体外生长发育和形态的影响。每天在倒置显微镜下观察毛囊形态,并用测微尺度量毛纤维的生长数据,计算毛囊前9天的生长速度和最终的生长长度。结果显示:向无血清的Williams E培养基中添加2~10ng/mL浓度的VEGF和IGF-I细胞因子有明显的促进毛囊发育和毛发生长的作用;向无血清的Williams E培养基和无血清的DMEM培养基中加入10ng/mL浓度的IGF-I,可刺激毛囊外根鞘细胞向一侧增殖、迁移,从而使整个毛囊形成弯曲。三、体外培养条件下毛囊形态的变化及其影响因素毛囊在体外培养条件下,初期的生长发育和在体内皮肤中的发育区别不大。毛球呈圆球形,毛乳头明显,结缔组织性鞘细胞纤维规则排列,与毛母质界限分明,呈锥形嵌入,毛干及内、外根鞘之间的界限清晰。在加入IGF-I、VEGF等生长因子初期,毛乳头仍清晰,毛囊的生长表现为毛干及内、外根鞘的延长,而结缔组织鞘无明显变化。随着培养时间的延长,毛干与内皮根鞘之间的界限会逐渐变得模糊。在培养的后期,毛囊形态结构会发生明显的变化,主要表现为,毛球变成为长杆状,变细而失去圆形;毛乳头不明显或消失,毛母质细胞分裂减弱;内根鞘与外根鞘界限模糊;结缔组织性鞘细胞纤维排列杂乱,结缔组织细胞减少。随着培养时间的继续延长,毛母质萎缩,远离毛乳头;毛乳头变小而聚缩成团;毛囊的层次结构界限模糊;毛球部扭曲变形。总之,整个毛囊失去典型的结构特征,最终毛囊根部呈杵状,毛囊停止生长。四、青山羊皮肤成纤维细胞系的建立和维持采用组织块法原代培养青山羊皮肤成纤维细胞并进行传代,将新鲜的青山羊皮肤组织切成1mm3大小的组织块,放入优化的培养基中进行体外培养。通过传代、纯化与冻存等精心管理,成功建立了和维持了青山羊皮肤成纤维细胞系。五、青山羊毛囊外根鞘细胞系的建立和长期保存采用酶消化与机械拔除相结合的方法分离出完整毛囊,立即放入优化的培养基中进行体外原代培养,通过换液、传代、纯化与冻存等精心操作,成功建立和维持了青山羊毛囊外根鞘细胞系。本研究优化了山羊皮肤和毛囊体外培养条件,研究了细胞因子对毛囊的影响,成功建立了青山羊皮肤成纤维细胞系和毛囊外根鞘细胞系,为揭示山羊毛囊分化发育与羊毛生长的影响因素和调控机理奠定了基础和提供了模型;并为医学研究和发现毛发疾患病因、探讨药物治疗作用机理等提供了借鉴。本研究所涉及的细胞因子和培养条件等,多数反映了一般实验条件下这些常见因素的互作,期望能为人类毛发再生和白发问题研究提供借鉴。