论文部分内容阅读
背景与目的:肝细胞癌(HCC)是全球恶性肿瘤中最为常见之一,也是全球第二大癌症死亡原因,每年约有745,500人死亡。肝癌侵袭性强,复发率高,预后极差。肝癌易发生化疗耐药,常规化疗在晚期肝癌患者中疗效不佳。化疗耐药已然成为肝癌治疗失败的主因之一。因此,能否揭开肝癌化疗耐药的分子机制的谜团,从而有效解决化疗的耐药困境,已成为肝癌治疗成功与否的关键。Six2是Six同源框家族成员之一,参与间充质-上皮转化,参与肾脏的发育过程,起到促进肾间质细胞增殖,抑制细胞凋亡的作用。Six2缺乏导致间质祖细胞缺失、分化失调和严重肾发育不全。此外,Six2可以在哺乳动物肾脏发育过程中标记和调节多能自我更新的肾单位祖细胞。既往有研究表明,Six2促进乳腺癌的转移。KM plotter在线分析显示肝癌患者Six2表达水平与其总生存负相关。由于作用于胚胎发生的基因表达程序和细胞过程常在肿瘤中再现,尤其肿瘤干细胞可能导致细胞转移。而上皮-间充质转换(EMT)过程可能赋予了肿瘤细胞干性特征。肿瘤细胞干性和EMT与肿瘤化疗耐药及转移密切相关。因此,我们推测Six2基因的异常表达与肝癌细胞EMT的发生及干细胞表型的获得相关。E-cadherin是EMT的上皮标记物,作为肿瘤抑制基因参与肿瘤的转移和细胞干性的调节。然而,E-cadherin在肝癌中的调控机制仍不甚明了。并且,Six2在肝癌化疗敏感性中的作用也尚不清楚。为了明确Six2在肝癌的预后生存及化疗耐药中是否起作用及其可能的机制?本课题做了如下研究:材料与方法:1、采用免疫组织化学法、qRT-PCR和Western blot等技术检测Six2蛋白在肝细胞癌组织、配对癌旁正常组织以及肝癌细胞系中的表达情况,基于利用KM plotter在线工具对364例肝癌患者进行Six2表达程度与总生存率的相关性分析。2、应用干扰技术有效敲低Six2表达,利用5-氟尿嘧啶(5-FU)诱导肝癌细胞凋亡,采用CCK8法和细胞凋亡检测Six2干扰与否对经5-FU处理后肝癌细胞活性和细胞凋亡的影响;并采用Western blot技术检测凋亡相关蛋白的表达。并进一步采用Spheroid成球实验、ALDH活性检测观察Six2干扰与否对肝癌细胞“干性”特征的影响,利用qRT-PCR技术检测Six2干扰与否对肝癌细胞中干细胞标志物基因的影响。3、建立过表达Six2和E-cadherin肝癌细胞,利用qRT-PCR和Western blot技术检测肝癌细胞中Six2不同表达对应E-cadherin的表达情况。利用5-FU诱导肝癌细胞凋亡,利用CCK8和Western blot技术分别检测细胞活性和凋亡相关蛋白的表达来验证E-cadherin表达与Six2介导的5-FU敏感性的关系。并进一步采用Spheroid成球实验、ALDH活性检测和干细胞标志物基因mRNA水平的检测验证E-cadherin表达与Six2介导肝癌细胞干性特征的关系。4、利用qRT-PCR和Western blot技术检测DNA甲基转移酶抑制剂地西他滨5 uM处理Six2过表达与否的肝癌细胞中E-cadherin表达情况,采用甲基化特异性PCR检测Six2过表达与否的肝癌细胞中E-cadherin基因启动子CpG岛甲基化状态,以及L02,HepG2和Huh7细胞株中E-cadherin甲基化水平的差异,qRT-PCR验证肝癌组织中Six2和E-cadherin表达相关性。结果:1、HCC组织和细胞中Six2表达增高且与预后不良相关41例肝癌组织中Six2蛋白阳性表达率达39.0%,41例配对癌旁正常组织中Six2蛋白阳性表达率达12.2%(P<0.01);肝癌组织中Six2的mRNA和蛋白水平均高于正常组织(P<0.01),Six2的表达量与AFP值相关,而与年龄、性别、HBsAG、肿瘤大小,分化程度及临床分期无关。在肝癌细胞中Six2的表达均高于正常肝细胞(L02细胞株),尤其在HepG2和Huh7细胞株中(P<0.01)。KM分析显示,高表达Six2的HCC患者为45.1%(164/364),总体生存率明显低于低表达的HCC患者,有统计学差异(P<0.05)。2、Six2对肝癌细胞5-FU敏感性的负调控作用并增强肝癌细胞干性特征肝癌细胞株经有效敲低Six2表达后,与对照组比较,Six2-shRNA处理可增加5-FU诱导产生的凋亡率,使细胞活性下降(P<0.01);并使得细胞中凋亡相关蛋白cleaved caspase-3和cleaved PARP的蛋白表达增高。有效敲低Six2与5-FU具有协同作用。Six2敲低可使肝癌细胞Spheroid成球能力、ALDH1活性均显著下降(P<0.01);干细胞标志物蛋白Nanog和ALDH1表达下调。3、Six2通过调节E-cadherin表达控制肝癌细胞对5-FU敏感性和干性特征在Six2过表达或敲低的细胞中,E-cadherin的表达分别降低或增加(P<0.01),在Six2过表达的细胞中转染E-cadherin过表达病毒,E-cadherin的表达恢复,我们观察到E-cadherin的重新表达挽救了 Six2过表达细胞对5-FU的敏感性(P<0.01),足以恢复Six2过表达细胞中5-FU诱导的细胞凋亡。此外,恢复E-cadherin的表达减弱了 Six2过表达介导的肝癌干细胞的上调,其特征是干细胞标记物(ALDH 1和Nanog)表达减少,细胞球大小和数量减少,ALDH 1活性降低(均P<0.01)。4、Six2通过激活E-cadherin启动子甲基化抑制其表达使用5 μM甲基转移酶抑制剂Decitabine处理Six2过表达的肝癌细胞后,E-cadherin表达部分恢复(P<0.01),而对照组细胞E-cadherin表达无进一步增加(P>0.05)。E-cadherin启动子甲基化分析表明,Six2过表达的肝癌细胞E-cadherin CpG岛甲基化显著增加(P<0.01),表达高水平Six2和低水平E-cadherin的肝癌细胞呈现出高表达的E-cadherin启动子甲基化。而表达低水平的Six2和高水平的E-cadherin的正常肝细胞L02则相应地则呈现低表达的E-cadherin启动子甲基化(P<0.01)。相对应的,41例肝癌组织中Six2和E-cadherin的表达呈负相关(R2=0.4167,P<0.01)。结论:1、Six2可能参与HCC的进展;2、Six2可通过增强肝癌细胞的干细胞来降低肝癌细胞的化疗敏感性;3、Six2通过调节E-cadherin的表达,调节5-FU的敏感性和肝癌细胞干性;4、Six2可通过改变E-cadherin启动子的甲基化状态来抑制其表达。