丙酮丁醇梭菌ABE (Acetone-Butanol-Ethanol)发酵从其开始到现在已经有100多年的历史,是曾经仅次于酵母乙醇发酵的第二大发酵产业。但ABE发酵的发展经历诸多波折,最主要的原因就是受制于石油价格的波动。当石油价格下跌,ABE发酵就失去与石油基化学品的市场竞争力。因此提高ABE发酵本身的竞争力是摆脱石油价格困扰,实现自身可持续发展的重要途径。代谢工程改造是一种有效地改变细胞生理代谢特性的手段,其中辅因子作为影响生理代谢的重要因素,在细胞代谢中发挥重要作用。本论文从对丙酮丁醇梭菌的辅因子代谢进行扰动入手,研究辅因子代谢对ABE发酵的影响,主要包括：(1)引入能量代谢扰动,缩短发酵周期,提高溶剂产率。本研究通过过量表达丙酮丁醇梭菌自身的具有水解ATP功能的F1-ATPase,降低细胞能荷水平,导致细胞生长加快,糖代谢增强,ATP周转速率增加,增加NADH供给,使得发酵周期缩短约10h,溶剂的产量、得率和产率分别提高15%、4.2%、76%。另一方面,代谢流分析显示产酸期向产醇期的转变提前,说明降低细胞能荷水平是一种可以触发丙酮丁醇梭菌产酸到产醇转变的信号。这是对丙酮丁醇梭菌生理代谢特性的新认识。(2)引入还原力代谢扰动,将经典的ABE发酵改造为价值更高的IBE发酵。在ABE发酵中主要有三种产物：丙酮(Acetone)、丁醇(Butanol)和乙醇(Ethanol)。本研究在丙酮丁醇梭菌中引入一个消耗还原力的次级醇脱氢酶,将丙酮完全转化为了价值更高的异丙醇,一步法实现了经典ABE发酵向IBE发酵的完全转变。重组菌株48h批式发酵可以产生约24g/l的混合醇,其中包括15g/l丁醇、7.6g/l异丙醇和1.28g/l乙醇,总醇对葡萄糖的转化率达到31.4%。研究进一步揭示虽然引入还原力扰动,但从丙酮酸到丁酰辅酶A的消耗还原力的途径具有很强的鲁棒性,其代谢速率没有明显变化,而从酰基辅酶A到醇的消耗还原力的途径受到影响,丁醇和乙醇生产途径(retoh、rbuon)的反应速率下降,这说明该途径的醛／醇脱氢酶受还原力的扰动作用更大。(3)进一步解析丙酮丁醇梭菌醛／醇脱氢酶失活后造成的还原力扰动对产醇的影响,提高丁醇选择性。丙酮丁醇梭菌有多个依赖NADH的醛／醇醇脱氢酶(AdhE1、AdhE2、BdhA、BdhB、Cac3392、Cap0059),它们具有不同底物特异性,胞内还原力在其之间的分配利用影响丁醇在溶剂中的比例。丁醇作为ABE发酵中价格最高的产物,提高其在总溶剂中比例是提高ABE发酵经济性的另一个重要途径。本研究通过二型内含子敲除技术对这些醇脱氢酶进行了失活,发酵评价了这些基因对于生产丁醇乙醇的影响,研究发现adhe1和bdhB基因对于丙酮丁醇梭菌产醇至关重要,这两个基因失活后,突变体菌株产醇能力下降,其中adhe1基因突变体菌几乎丧失产醇能力。adhe2基因失活后,突变体菌株产醇能力增加,丁醇的产量可以达到16.3g/l,增加12.5%,乙醇产量达到2.0g/l,降低7%。丁醇乙醇比例由野生型的6.65：1提高到8.15：1。bdhA基因失活后,突变体菌株丁醇产量没有明显变化,而乙醇产量提高42.3%,丁醇乙醇比例下降到5.6：1。cac3392基因失活突变体菌株丁醇产量相比野生型菌株没有明显变化,但乙醇产量下降32.6%,丁醇乙醇比例提高到10.2：1。cap0059基因插入失活突变体丁醇产量提高7.7%,达到15.4g/l,乙醇产量为1.45g/l,降低32.6%,丁醇乙醇比例提高到10.6：1。这一工作为进一步改造丁醇代谢流,提高丁醇选择性,实现丙酮丁醇梭菌同型丁醇发酵提供了基础。本论文通过辅因子工程对丙酮丁醇梭菌的能量代谢和还原力代谢进行扰动,缩短丙酮丁醇梭菌的发酵周期,提升生产效率；一步法实现ABE发酵价值更高的IBE发酵的转变；解析醛/醇脱氢酶失活造成的还原力扰动对产醇的影响,为进一步提高丁醇选择性打下了基础。这些工作从辅因子代谢扰动的角度提高了丙酮丁醇梭菌ABE发酵的性能,为提高ABE发酵的市场竞争力,促进ABE发酵稳定发展提供了新的出路。