肿瘤组织中普遍存在着缺氧状态。缺氧诱导因子-1α(hypoxia-induciblefactor-1 alpha,HIF-1α)是缺氧状态时广泛存在的一种转录因子,在介导肿瘤缺氧反应中发挥重要作用。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是HIF-1α重要的靶基因,是一种内皮细胞专一性丝裂原和血管新生强烈的刺激因子,是恶性肿瘤诱导血管生成的重要调控因子。除了肿瘤细胞产生一系列的缺氧适应性反应外,在肿瘤组织缺氧区域中的肿瘤相关巨噬细胞聚集在血管生成中也具有重要作用。环氧化酶2(Cycloxygenase-2,COX-2)为前炎性因子,通常在组织缺氧或损伤反应中由巨噬细胞和单核细胞产生,COX-2的代谢产物PGE2和PGI2通过活化VEGF而直接刺激血管生成。血管生成是指从现有的微血管系统中生成新血管的过程。由于机体对肿瘤的制约能力差,肿瘤内部血管大量形成,但肿瘤血管通常是扩张的,形状呈不规则扭曲,具有与正常血管不同的多重特征。近年来Jain等提出,抗血管生成疗法能使非正常结构和功能的肿瘤血管趋向正常化,从而有利于氧气和药物进入肿瘤,增强肿瘤对药物的敏感性。已有临床前和临床研究资料显示,抗血管生成药物辅助化疗药物的疗法能大大增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。青蒿素(artemisinin)是我国科学家首次从植物黄花蒿Artemisia annua Linn中提取的一种新型的倍半萜内酯。本课题组的前期研究表明,二氢青蒿素(dihydroartemisinin,DHA)等青蒿素类药物能抑制肺癌(Lewis)、人多发性骨髓瘤(RPMI8226)以及人白血病(K562,HL60)等多种恶性肿瘤的VEGF或VEGF受体KDR/flk-1表达,具有潜在的抗肿瘤血管生成作用。最近又在lewis肺癌动物模型证实,二氢青蒿素能增强环磷酰胺对Lewis肺癌生长和转移的治疗作用,获得良好的实验性治疗效果。从缺氧到VEGF表达增多的过程中HIF-1α起到了桥梁作用,对于二氢青蒿素是否通过调控VEGF的上游基因HIF-1α而下调VEGF表达还未见报道。本论文采用A549与A549/DDP肺腺癌荷瘤动物模型研究二氢青蒿素增强顺铂对A549与A549/DDP肺腺癌生长的治疗作用,并进一步从细胞,组织以及肿瘤相关巨噬细胞三个方位分析两药合用对HIF-1α介导的肺腺癌血管化的调控作用,从细胞增殖和凋亡两个方向分析二氢青蒿素与顺铂合用对A549和A549/DDP肺腺癌细胞的协同作用。旨在探讨青蒿素类药物增强化疗药物抗肿瘤作用的内在相关因素和时效规律,从细胞分子水平研究其增强顺铂治疗作用的可能机制,为评价二氢青蒿素的抗肿瘤作用及临床应用前景提供更有力的药理学依据。结果:1.二氢青蒿素增强顺铂对A549及A549/DDP肺腺癌的治疗作用1.1抑制肿瘤生长实验结果表明,在荷A549肺腺癌小鼠肿瘤模型中,三个剂量的二氢青蒿素联合顺铂用药组的肿瘤生长速度缓慢,体积增长速度较溶剂对照组与二氢青蒿素单用组及顺铂单用组缓慢,且在治疗结束后肿瘤重量均较溶剂对照组明显减少(p＜0.001)。这种联合用药的治疗效果在耐顺铂的荷A549/DDP肺腺癌模型更佳,各组与溶剂对照组相比都有显著性差异(p＜0.001),且其中各合用组与各相应的单用二氢青蒿素组,单用顺铂组相比均有明显差异(p＜0.05)。1.2药物的毒副作用用药期间,各组荷瘤小鼠活动良好,未见特殊不良反应,无一例死亡。荷A549肺腺癌小鼠用药12天后,溶剂对照组及治疗各组小鼠去瘤体重无显著差异。荷A549/DDP肺腺癌小鼠用药28天后,对照组及治疗各组小鼠去瘤体重比较也无显著差异。说明在本实验的给药方案下药物对小鼠没有明显的毒副作用。1.3荷A549/DDP肺腺癌模型肿瘤组织/血浆中顺铂含量等离子体发射光谱分析测定表明,在荷A549/DDP肺腺癌小鼠的肿瘤组织中,三个剂量的二氢青蒿素联合顺铂,使肿瘤组织中顺铂含量明显递增,在二氢青蒿素剂量0～100mg/kg的范围内,肿瘤组织中顺铂含量与二氢青蒿素剂量呈良好的线性关系,r=0.9993。随肿瘤组织中顺铂含量递增,肿瘤重量呈递减趋势。2.二氢青蒿素增强顺铂抑制低氧环境A549及A549/DDP肺腺癌细胞生长2.1抑制A549及A549/DDP肺腺癌细胞增殖作用MTT实验结果表明,用二氢青蒿素和顺铂处理48h后,A549与A549/DDP细胞增殖均被明显抑制,特别在两药合用组中细胞的抑制尤为明显,且随药物浓度增加抑制率呈递增趋势。通过Caculsyn2.0软件计算得到二氢青蒿素和顺铂两药合用的协同系数CI值,在A549细胞中平均值为0.6706,在A549/DDP细胞中平均值为0.5674,均小于1,说明二氢青蒿素和顺铂联合应用能对A549与A549/DDP细胞发挥协同抑制作用。2.2诱导A549及A549/DDP肺腺癌细胞凋亡的流式定量分析经流式细胞仪分析得,A549细胞经5.68mg/L二氢青蒿素,3.75mg/L顺铂作用48h后,细胞凋亡百分率有明显增加。特别是二氢青蒿素与顺铂合用组的凋亡率高达65.70%(P＜0.001)。A549/DDP细胞经11.36mg/L二氢青蒿素,7.5mg/L顺铂作用48h后,细胞凋亡百分率亦有明显增加。特别是二氢青蒿素与顺铂合用组的凋亡率高达60.00%(P＜0.001)。3.二氢青蒿素对HIF-1α介导的肺腺癌血管化的调控研究3.1下调低氧环境A549及A549/DDP肺腺癌细胞HIF-1α和VEGF蛋白表达Western blotting实验表明,二氢青蒿素能显著下调A549细胞及A549/DDP细胞HIF-1α,VEGF蛋白的表达,在与顺铂的合用组中下调作用尤为明显,且呈作用时间依赖性。在A549细胞中,当药物作用12h,HIF-1α,VEGF蛋白在给药组中的表达与溶剂对照组无显著性差异;作用24h后,合用组中HIF-1α和VEGF蛋白表达量相对于溶剂对照组分别下降了42.7%、44.3%(P＜0.01,P＜0.01);作用48h后,则合用组中HIF-1α和VEGF蛋白表达量相对于溶剂对照组分别下降了61.6%、78.0%(P＜0.001,P＜0.01)。在A549/DDP细胞中,当药物作用12h,HIF-1α,VEGF蛋白在给药组中的表达与溶剂对照组无显著性差异;作用24h后,合用组中HIF-1α和VEGF蛋白表达量相对于溶剂对照组分别下降了37.2%、29.6%(P＜0.05,P＜0.05);作用48h后,则合用组中HIF-1α和VEGF蛋白表达量相对于溶剂对照组分别下降了54.1%、41.9%(P＜0.01,P＜0.05)。3.2下调A549及A549/DDP肺腺癌组织HIF-1α和VEGF蛋白表达免疫组织化学检测结果显示,HIF-1α与VEGF蛋白在A549肺腺癌移植瘤的溶剂对照组中均呈中等阳性表达,在顺铂单用组中的表达量稍弱于溶剂对照组,各二氢青蒿素单用组及两药合用组肿瘤细胞内两蛋白均呈弱阳性表达。在A549/DDP肺腺癌移植瘤的溶剂对照组中HIF-1α和VEGF蛋白都呈强阳性表达,顺铂单用组中两蛋白的表达量与溶剂对照组相近,然而在各二氢青蒿素单用组及两药合用组中HIF-1α与VEGF蛋白均呈弱阳性表达。3.3下调A549及A549/DDP肺腺癌组织COX-2蛋白表达COX-2蛋白在A549肺腺癌移植瘤的溶剂对照组表达呈中等阳性,在顺铂单用组中表达量稍弱于溶剂对照组,而在各二氢青蒿素单用组及两药合用组肿瘤细胞内表达量极弱。在A549/DDP肺腺癌移植瘤的溶剂对照组中COX-2蛋白呈强阳性表达,在顺铂单用组及各二氢青蒿素单用组中则呈中等阳性表达,而在各两药合用组中表达极弱。3.4抑制肿瘤组织微血管密度以内皮细胞特异标记物CD31蛋白作为微血管定量指标,观察统计结果表明,在A549和A549/DDP移植瘤组织,各二氢青蒿素单用组的微血管数量与溶剂对照相比较均有显著性下降(P＜0.05或P＜0.01),同时二氢青蒿素与顺铂合用组的微血管密度与各自的单用组相比也有显著下降(P＜0.05或P＜0.001)。以肿瘤组织NG2蛋白多糖作为成熟微血管定量指标,经微血管计数表明,在A549和A549/DDP移植瘤组织中各二氢青蒿素单用组的微血管数量与溶剂对照组相比均有显著性下降(P＜0.05或P＜0.01),且二氢青蒿素与顺铂合用组的微血管密度与溶剂对照组以及顺铂单用组相比都有显著性下降(P＜0.05或P＜0.01)。以上研究结果表明:(1)二氢青蒿素与顺铂合用能有效抑制A549及A549/DDP肺腺癌移植瘤的生长;下调肿瘤组织内HIF-1α,COX-2,VEGF;抑制肿瘤组织新生微血管与成熟微血管密度;能明显递增肿瘤组织中顺铂含量。(2)二氢青蒿素与顺铂合用能有效增强对低氧环境培养的A549及A549/DDP肺腺癌细胞的毒性作用;呈时间依赖性下调肿瘤细胞内的HIF-1α和VEGF蛋白表达;能明显提高肿瘤细胞凋亡率。结论:二氢青蒿素能增强顺铂对A549及A549/DDP肺腺癌的治疗作用,其机制可能与二氢青蒿素能下调A549和A549/DDP肺腺癌细胞内HIF-1α和VEGF的表达,抑制肿瘤血管生成,并提高A549和A549/DDP肺腺癌细胞凋亡率有关。