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第一部分QF-PCR检测22q11.2微缺失方法的建立研究目的以TBX1基因附近SNP位点作为靶位点,探讨运用荧光定量PCR检测22q11.2微缺失的准确度及灵敏度,在此基础上,建立一种准确度高、特异性强、快速、高通量、费用低且适合在国内开展的诊断22q11.2DS的方法。方法和材料1研究对象2010年10月至2011年5月在天津市儿童医院进行CHD手术的患儿84例,年龄1个月～14岁,平均年龄(2.55±0.36)岁。另选30例在儿童医院进行查体的健康儿童作为对照组。2研究材料抽取患者外周血4ml,其中,2ml用于淋巴细胞培养、染色体核型分析,1ml采用酚-氯仿的方法提取DNA并保存于-20℃备用；另1ml按FISH处理方法进行离心、低渗、固定处理并保存于-20℃备用。3染色体核型分析实验组及对照组所有样本通过普通光学显微镜进行染色体核型分析,计数30个核型,分析5个。根据染色体核型分析结果将所有样本分成核型正常组和核型异常组。4QF-PCR对染色体核型正常的实验组及对照组进行QF-PCR检测。选取位于22号染色体TBX1基因上游4660bp的SNP位点rs9618682(G/A)作为本研究的靶位点,19号染色体上的PTBP1基因作为内参基因。将原始数据、扩增曲线等信息从定量软件中导出进行分析,得到样本基因相对表达量rGCN及图谱。rGCN=1时,表示无缺失,rGCN=0.5时,表示有缺失。5FISH对染色体核型正常的实验组和对照组进行FISH检测。应用双色荧光探针,以位于22q11.2区域的TUPLE1基因为目标基因,显示红色荧光信号；位于22q13.3区域ARSR基因为对照基因,显示绿色荧光信号,按FISH程序进行制片、干燥、变性、杂交、后洗、染色和镜检。正常诊断标准：单个细胞内红、绿色信号各2个。22q11.2DS诊断标准：单个病例中大于60%的单个细胞内绿色信号2个,红色信号缺失1个。6统计学分析将QF-PCR与FISH两种方法结果对比,统计学分析。结果1染色体核型分析结果84例CHD患儿中共检出异常核型2例,包括1例46,XX,inv(9)(p11q12),1例46,XY,16qh+.对照组染色体异常核型0例。2DNA提取的质量用酚-氯仿的方法提取外周血DNA,DNA的浓度在44.61ng/μ1～161.2ng/μl,A260/280在1.65～1.85之间。3QF-PCR检测结果82例染色体正常的CHD患儿中,77例的TBX1与PTBP1基因拷贝数的比值为(0.922±183),接近于1；5例患儿的比值明显降低,为(0.512±0.046),接近于0.5。对照组TBX1与PTBP1基因拷贝数的比值为(0.929±0.220),接近于1。且5例患儿均与正常人群的比值无交叉重叠。4FISH检测结果FISH检测82例染色体核型正常的CHD患儿中,发现5例有22q11.2缺失,余未见缺失；且检测结果与QF-PCR检测的结果完全一致。30例对照组均未见缺失。5统计学分析QF-PCR检测灵敏度100%,特异度100%,Kappa值1.0。实验组先天性心脏病患儿中,22q11.2微缺失检出率为6.10%(5/82)；在对照组,22q11.2微缺失检出率为0%(0/30),行Fisher精确概率法检测,实验组与对照组22q11.2微缺失检出率之间存在明显差异p=0.048(<0.05)。结论1SNPrs9618682位点是检测22q11.2微缺失非常重要的一个靶位点。2QF-PCR检测22q11.2微缺失准确度高、特异性强,快速、简便、高通量,可以作为22q11.2DS的诊断依据,为明确CHD患儿病因提供可靠的实验室证据。3本实验通过对实验组及对照组22q11.2微缺失的检测结果比较得出结论,22q11.2微缺失是引起CHD最重要遗传学病因之一。第二部分QF-PCR检测22q11.2微缺失在产前诊断中的应用研究目的将QF-PCR法应用于CHD的产前诊断中,以明确部分CHD病因,指导临床决策,降低我国的围产儿死亡率及CHD出生缺陷率,从而提高出生人口的质量。方法和材料1研究对象2011年5月至2013年3月在天津市中心妇产科医院经B超诊断为CHD的胎儿45例,胎龄20～30周,平均胎龄(24.33±1.28)周；另选30例经B超诊断正常、因计划外怀孕需做引产的胎儿作为对照组。2研究材料孕妇签署知情同意书后,常规皮肤消毒铺巾,B超引导下进行羊水穿刺术,取羊水30m1于无菌离心管中。10m1用于胎儿羊水培养、染色体核型分析,10ml羊水采用酚-氯仿的方法提取DNA并保存于-20℃备用；另10m1羊水按FISH处理程序进行离心、低渗、固定处理并保存于-20℃备用。3染色体核型分析实验组及对照组所有样本通过普通光学显微镜进行染色体核型分析,计数30个核型,分析5个。根据染色体核型分析结果将胎儿分成核型正常组和核型异常组。4QF-PCR对染色体正常的CHD胎儿样本及对照样本进行QF-PCR检测,方法同第一部分QF-PCR法。5FISH验证对QF-PCR检测有缺失CHD胎儿进行FISH验证。方法同第一部分FISH检测法。结果1染色体核型分析结果45例CHD例胎儿共检出异常核型3例,1例47,XX,+21,1例47,XX,+13,1例46,XX,inv(9)(p11q12)。2DNA提取的质量用酚-氯仿的方法提取羊水DNA,提取DNA的浓度在44.31ng/μl～160.1ng/μl, A260/280在1.63～1.81之间。3QF-PCR检测结果42例染色体正常CHD胎儿中,40例TBX1与PTBP1基因拷贝数的比值为(0.936±0.310),接近于1；2例胎儿的比值明显降低,为(0.507±0.038),接近于0.5。对照组TBX1与PTBP1基因拷贝数的比值为(0.918±0.306),接近于1。且2例胎儿均与正常人群的比值无交叉重叠。4FISH检测结果QF-PCR检测有缺失的2例胎儿均经FISH验证为阳性,QF-PCR检测结果与FISH结果一致。结论QF-PCR检测结果可靠,可用于产前诊断CHD的胎儿,有助于孕妇选择、孕期管理和遗传咨询,达到优生优育的目的。