肿瘤血管新生在肿瘤生长和转移过程中起着关键性作用。近年来,新生血管抑制剂与化疗药物被联合用于肿瘤的治疗,并取得了良好的临床治疗效果。但这种药物的联合使用在临床也产生了新的问题,比如：肿瘤血液供应的切断,会导致化疗药物无法达到肿瘤组织,从而影响药效的持续性发挥；其次,肿瘤部位营养和氧气供应的切断,会使肿瘤细胞表达更多的缺氧耐受因子,使肿瘤细胞的侵袭力增加,从而容易诱发肿瘤转移,增加肿瘤治疗的难度。为了解决肿瘤联合给药出现的问题,本文制备了具有核-壳结构的核壳型脂质纳米粒(LNP)程控式给药系统,在纳米粒核中负载阿霉素(DOX),脂质体外壳负载双氢青蒿素(DHA)以实现DHA和DOX的先后释放,抑制肿瘤血管新生的同时,实现在肿瘤组织持续化疗的目的。此外在肿瘤新生血管内皮细胞上,具有高表达的αvβ3受体,c(RGD)fk肽可以与之特异性结合。利用这一性质,我们以c(RGD)fk肽为肿瘤特异性配体,制备了c(RGD)fk-聚乙二醇-胆固醇(Chol-PEG-c(RGD)fk)接枝共聚物,并将其修饰到双载药的核壳型脂质纳米粒(D-LNP)的表面,以提高肿瘤部位靶向性,减少毒副作用。所制备制剂不但实现了药物的梯度释放,而且可以通过肿瘤血管的靶向性,直接将药物运输到肿瘤组织,提高制剂的作用效率。相关研究工作的主要内容及结果如下：首先,制备给药系统的“核”-DOX-PLGA纳米粒。利用两步反应制备DOX-PLGA接枝共聚物,并用核磁共振、GPC等方法对其结构进行表征。以双十二烷基二甲基溴化铵为乳化剂,采用乳化分散挥发法制备DOX-PLGA纳米粒,考察了不同工艺对纳米粒粒径、载药量和包封率的影响。结果表明,纳米粒粒径受乳化剂浓度、有机溶剂种类的影响,粒径分布在100～200 nm,zeta电位为57.0～60.4 mV。载药量和包封率不受粒径大小的影响。透射电镜结果表明,PLGA纳米粒呈球形,大小均一；扫描电镜结果表明PLGA纳米粒表面形态光滑,为刚性结构。X射线衍射的结果表明,阿霉素以无定形形式存在于纳米粒中。体外释放结果表明,阿霉素PLGA纳米粒在偏酸性环境中的释放较快。稳定性研究表明,纳米粒溶液相对稳定,增加溶液的离子强度,有利于纳米粒的收集。然后,采用薄膜分散法制备具有核-壳型结构的双载药LNP,并考察纳米粒浓度,药脂比等因素对DHA载药量和包封率的影响。结果表明,随着纳米粒比表面积和磷脂浓度的增加,DHA的包封率和载药量均有所提高,最大载药量为3.58%。LNP的平均粒径分布在100～300 nm, zeta电位在-8.5～-6.3 mV之间。之后,对LNP进行功能化修饰。首先合成Chol-PEG-c(RGD)fk接枝共聚物,通过红外光谱、核磁共振、GPC对其进行表征；然后将Chol-PEG-c(RGD)fk偶联到核壳型脂质纳米粒表面。透射电镜观察LNP和c(RGD)fk-LNP的形态,结果表明,核壳型脂质纳米粒呈球形,分布均匀,脂质外壳厚度约为20 nm。扫描电镜的结构表明核壳型脂质纳米粒表面出现了退行性变化,表现为脂质体的囊泡结构特征。X射线衍射结果表明,两种药物均以无定形的形式存在于纳米粒中。激光共聚焦显微镜结果表明,阿霉素标记的PLGA内核可以与NBD-PE标记的磷脂外壳完全的重合。小角度X射线散射衍射结果表明,LNP存在着核壳型结构,并且Chol-PEG-c(RGD)fk的表面修饰使磷脂外层的结构发生改变。X射线光电子能谱的结果表明,阿霉素PLGA纳米粒被完全包裹在磷脂层内。体外释放结果表明,双氢青蒿素与阿霉素在核壳型脂质纳米粒制剂中为程序性梯度释放,这有利于核壳型脂质纳米粒协同发挥新生血管抑制剂和化疗制剂的疗效。核壳型脂质纳米粒的稳定性研究表明,LNP和c(RGD)fk-LNP的粒径在溶液中有增加趋势,应冷冻干燥保存。采用MTT法评价了空白PLGA-NP,LNP和c(RGD)fk-LNP的细胞毒性,结果表明磷脂层的包裹可以改善阳离子纳米粒的生物相容性,所制备的LNP基本无细胞毒性。同时考察了游离阿霉素,游离双氢青蒿素以及两者配伍使用时对肿瘤细胞的细胞毒性作用,结果表明,游离DOX与DHA均有细胞毒性,DHA对细胞无选择性,但DOX对耐药株毒性较弱。DHA与DOX可显著提高DOX的抗肿瘤效率,两者协同作用可在一定程度上逆转MCF-7/ADR细胞的耐药性。结合激光共聚焦显微镜和流式细胞术结果,可以看出,通过核壳型核壳型脂质纳米粒的负载,DOX可靶向蓄积在肿瘤细胞的细胞核。这种胞内的分布可能与DMAB分子可以引起内吞体膜的破裂有关。载体的细胞核靶向有利于进一步的增加药物的细胞毒性,提高对耐药细胞的逆转效率。采用荷S180瘤ICR小鼠模型,建立HPLC检测小鼠血浆和组织样品的阿霉素含量测定方法,考察核壳型脂质纳米粒在荷瘤小鼠体内的组织分布。结果表明,LNP组和c(RGD)flk-LNP组的AUC0.∞是阿霉素组的2.43倍和2.71倍,c(RGD)fk介导的LNP可以降低消除速率,延长平均滞留时间,增加载体在肿瘤组织的分布,提高靶向性,降低在心脏和肾脏的药物分布及毒性。此外,核壳型脂质纳米粒与游离的阿霉素相比,在肝脏,脾脏等网状内皮系统的聚集增加。最后,构建小鼠的S180移植瘤和B16肺转移瘤模型,进行核壳型脂质纳米粒抗肿瘤的药效学研究。结果表明,c(RGD)fk介导的核壳型脂质纳米粒组对S180的抑瘤率可达79.5%,远高于阿霉素与双氢青蒿素的混合物；对B16黑色素转移瘤也有明显抑制效果。对小鼠肿瘤的免疫组化研究表明,DHA可以下调COX-2的表达,进而抑制肿瘤的血管生长,使MVD值减小。但血管的生长抑制同样会引起缺氧耐受因子(HIF)的高表达。c(RGD)fk介导的核壳型脂质纳米粒组可以通过药物的程序性释放改善由血管新生抑制治疗引起的HIF高表达,体现了良好的治疗效果。此外心脏毒性研究发现,核壳型脂质纳米粒制剂可以显著降低阿霉素的心脏毒性。