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研究背景和研究目的：肝细胞肝癌是最常见的恶性肿瘤之一,恶性程度高,预后差,探索肝细胞肝癌的发病机制是临床研究的重大课题。研究表明,CR-1在早期胚胎发生尤其是干细胞自我更新、维持多向潜能及生存方面发挥关键作用的基因,往往也与恶性肿瘤的发生发展存在着密切的关系。癌胚基因Cripto-1(CR-1)在胚胎发育和肿瘤发生发展及转移过程中发挥多项重要调节作用,在乳腺癌、肺癌、胃癌和结直肠癌等肿瘤中异常高表达,且其表达水平与肿瘤浸润深度、淋巴结转移及复发成正相关,与预后成负相关。体内、体外实验均证明：拮抗CR-1的反义寡核苷酸及中性封闭CR-1的单克隆抗体能强烈抑制结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、睾丸癌及白血病癌细胞的生长。迄今,CR-1在肝癌中的作用尚不清楚,为此本课题将揭示CR-1在人肝细胞肝癌患者肝癌组织和肝癌细胞株上的表达谱,并利用肝脏特异表达人CR-1的转基因小鼠探讨CR-1在人肝癌发病机制中的作用,为进一步认识肝癌发病的分子机制和寻找新的早期诊断及治疗靶点提供线索和依据,具有较大的科学意义和社会价值。方法1.人肝癌组织和肝癌细胞株上CR-1表达水平检测采用荧光定量PCR、RT-PCR、Western blot和免疫组化等方法检测人原发性肝癌组织标本CR-1表达；应用引物UNA、UNB和UND检测人肝癌细胞系HepG2、Huh-7、SK-Hep-1和IPLC中CR-1中(?)nRNA转录本。2.运用RCLG转基因小鼠解析CR-1在肝癌发生发展中的作用RCLG转基因小鼠与Alb-Cre转基因小鼠交配而获RCLG/Alb-Cre双转基因小鼠,进而Cre介导重组在双转基因小鼠肝脏实现转基因CR-1过表达,随后在不同时间点(3周、3月、6月和8月)采集小鼠肝脏组织进行组织病理分析及其它相关检测与分析,以明确CR-1在肝癌发生发展中的作用及相关机制：①RT-PCR检测RCLG/Alb-Cre双转基因小鼠肝脏中CR-1表达水平；②取材过程中进行肝脏大体观察；③基于RCLG/Alb-Cre双转基因小鼠肝脏组织石蜡切片进行HE染色,而后进行病理分析,明确双转基因鼠肝脏病理变化(即正常组织→增生→非典型增生→原位癌等)；④借助BrdU或EdU标记进行细胞增殖检测以对双转基因鼠肝脏细胞增殖情况进行评价：在处死实验小鼠前4h,腹腔注射EdU (100 mg/kg body wt);⑤采用荧光定量PCR检测相关基因(如TGF-β1、Notch1、IL-6、IL-1β等)表达水平变化,进一步确认如上病理变化；⑥根据组织病理变化确定合适时间点,采集双转基因鼠肝脏组织,并提取总RNA,进而采用高通量方法(如基因表达谱芯片)筛选小鼠肝脏过表达转基因CR-1后的差异表达基因,以明确与肝癌发生发展密切相关的基因和信号通路等；⑦针对“⑥”中筛选出的可能在肝癌发生发展过程中起重要作用的特定基因和信号通路,采用常规分子生物学技术与方法进一步确认其具体作用及分子机制。结果1.人肝癌组织和肝癌细胞株上CR-1表达情况1.1 RT-PCR检测CR-1在人肝癌组织中的表达共收集21例原发性肝癌组织标本、18例癌旁标本。CR-1在肝癌及癌旁组织标本中主要表达1.7kb的短转录本,2kb的长转录本仅有少量表达。根据电泳图各条带的CR-1灰度值与GAPDH灰度值比率计算样本中CR-1表达水平,21例肝癌组织中有15例高表达。1.2荧光定量PCR检测CR-1在肝癌组织中的表达采用荧光定量PCR检测CR-1基因在肝癌组织、癌旁组织及正常肝组织中表达情况,进一步验证半定量RT-PCR的结果,结果表明荧光定量PCR结果与半定量RT-PCR结果一致。1.3 Western blot检测CR-1在肝癌组织中的表达CR-1在肝癌组织中表达水平明显高于同一病人的癌旁组织,采用ImageJ软件分析CR-1的表达与内参基因的灰度比值,最高的有16倍,最低的也有2倍以上,这种表达差异可能与肝癌细胞分化程度相关,需进一步统计分析。1.4免疫组织化学检测CR-1在肝癌组织标本中的表达免疫组化检测结果显示,CR-1信号主要定位在细胞浆,在肝癌细胞中呈中度或强表达。而在肿瘤周围相对正常组织、间质组织则为在细胞浆呈弱阳性或阴性表达。1.5 RT-PCR检测CR-1在肝癌细胞株中的表达采用RT-PCR检测CR-1基因在肝癌细胞株中的表达,结果显示在肝癌细胞株HepG2、Huh-7、SK-Hep-1、PLC及LO2中, CR-1存在两种转录本,但主要表达1.7kb的短转录本。总之,CR-1在人肝癌组织上表达水平上调,但其表达水平上调在人肝细胞肝癌发生发展中的临床意义仍不明确。且在人肝癌组织中及肝癌细胞株(HepG2. Huh-7、SK-Hep-1、PLC及L02)中均主要表达1.7kb短的转录本。2.运用RCLG转基因小鼠解析CR-1在肝癌发生发展中的作用2.1在RCLG/Alb-Cre双转基因鼠肝脏激活CR-1和Luc表达利用小动物活体成像仪在RCLG转基因鼠与Alb-Cre鼠交配所获后代中的部分个体肝脏可检测到Luc信号,预示Cre重组酶成功在肝脏介导重组,成功激活了下游Luc转基因表达；从Luc阳性的个体和Luc阴性的个体取出各自肝脏,利用小动物活体成像仪可在从Luc阳性个体取出的肝脏上检测到Luc信号,而在从Luc阴性个体取出的肝脏上则未检测到Luc信号,随后提取肝脏总RNA,行荧光定量PCR检测转基因CR-1表达,结果显示,在RCLG/Alb-Cre双转基因小鼠肝脏上可检测到转基因CR-1的表达,预示Cre介导DNA重组成功在肝脏激活了转基因CR-1表达。总之,运用Cre/lox P系统在转基因小鼠肝脏上实现了目的转基因Luc和CR-1条件性过表达。2.2 RCLG/Alb-Cre双转基因小鼠肝脏病理变化对出生3周、3月、6月和8月的RCLG/Alb-Cre双转基因小鼠肝脏行大体观察,未见异常；基于RCLG/Alb-Cre双转基因小鼠肝脏组织石蜡切片行HE染色而后进行组织病理学分析,双转基因小鼠肝脏组织结构未发生明显病理改变。借助EdU标记进行细胞增殖检测,证实3月龄、6月龄和8月龄的双转基因小鼠肝脏上存在肝细胞增殖。2.3转基因CR-1于肝脏过表达后相关基因表达水平变化采用荧光定量PCR检测相关基因(如TGF-β1、Notchl、IL-6、IL-1β、E-cadherin, vimentin等)表达水平变化,3周龄的双转基因鼠肝脏上TGF-β1、Notch1、IL-6和IL-1β基因表达水平未见明显变化,而6月龄双转基因鼠肝脏上TGF-β1、Notch1、IL-6和IL-1β基因表达水平上调了2～3倍,其生物学意义有待进一步实验确认。2.4利用基因表达谱芯片筛选转基因CR-1于肝脏过表达后差异表达的关键基因采集6月龄的RCLG/Alb-Cre双转基因鼠和对照鼠肝脏组织,并提取总RNA,经鉴定RNA质量符合芯片要求,采用基因表达谱芯片筛选小鼠肝脏过表达转基因CR-1后的差异表达基因。基因表达谱芯片筛查结果显示：根据表达差异2倍以上,发现总共有211个基因发生差异改变。其中有48个基因表达水平上调,163个基因水平表达下调；根据相关文献和基因芯片数据,筛选出可能与肝癌发生相关的基因(如LCN2、Orm2、Rgs16、Srebfl、TFF3、TFF2、CUZD1、DMBT1、GoS2、NuPR1、PDK4等),之后利用荧光定量PCR基于RCLG/Alb-Cre双转基因鼠肝脏标本及人的肝癌组织标本进一步验证基因芯片的结果,发现LCN2基因在肝癌组织和CR-1转基因小鼠中是表达上调的,GoS2、PDK4基因表达都是下调的,并且与基因芯片的结果一直,但是这三个基因具体生物学功能还有待进一步明确,与肝癌发生发展的潜在关系也待研究。结论1.CR-1在原发性肝癌组织中表达水平上调,且CR-1在肝癌细胞株和肝癌组织中主要表达1.7kb的短转录本；2.在RCLG/Alb-Cre双转基因鼠肝脏上成功激活CR-1和Luc表达；3.3月龄、6月龄和8月龄的RCLG/Alb-Cre双转基因小鼠肝脏未见明显病理学变化,但借助EdU标记进行细胞增殖检测,证实双转基因小鼠肝脏上存在肝细胞增殖；4.转基因CR-1于肝脏过表达后,3周龄的双转基因鼠肝脏上TGF-β1、Notch1、IL-6和IL-1β基因表达水平未见明显变化,而6月龄的如上基因表达水平上调了2～3倍；5.利用基因表达谱芯片筛选转基因CR-1于肝脏过表达后差异表达的关键基因,根据表达差异2倍以上,发现总共有211个基因发生差异改变。其中有48个基因表达水平上调,163个基因表达水平下调；根据相关文献和基因芯片数据,筛选出可能与肝癌发生相关的基因(如LCN2、Orm2、Rgs16、Srebf1、TFF3、TFF2、CUZD1、DMBT1、GoS2、NuPR1、PDK4等),之后利用荧光定量PCR基于RCLG/Alb-Cre双转基因鼠肝脏标本及人的肝癌组织标本进一步验证基因芯片的结果,发现LCN2基因在肝癌组织和CR-1转基因小鼠中是表达上调的,GoS2、PDK4基因表达都是下调的,并且与基因芯片的结果一直,但是这三个基因具体生物学功能还有待进一步明确,与肝癌发生发展的潜在关系也待研究。