器官和组织移植是20世纪最重要的医学成就之一，目前移植术已成为组织、器官功能衰竭终末阶段最有效的治疗措施。同种异基因移植是临床最常见的移植类型，无论何种移植，只要移植物表达与受者不同的蛋白质或其他分子，移植物就会被排斥。如何早期诊断排斥反应，是临床医生面临的重要问题。目前临床上观察急性排斥反应主要依据病人的症状，特别是移植脏器的功能指标或活体穿刺，无论何种手段，发现都晚，延误了时机。正在研究的与急性排斥反应有关的指标，例如CD4+或CD8+T淋巴细胞检测，IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α、IFN-γ等细胞因子检测，以及蛋白、酶类、补体和sCD30检测等，它们在敏感性、特异性和移植排斥早期检测上都存在一定的缺陷。现在仍未找到公认的、无创伤性的、敏感性和特异性均足以应用于临床监测的指标，本实验的研究目的主要是寻找更好的移植排斥检测指标。外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)主要为淋巴细胞和单核细胞，其中绝大多数为淋巴细胞。MHC-Ⅰ类分子几乎存在于所有有核细胞，外周血淋巴细胞表达MHC-Ⅰ类抗原量最多，现已确定，移植排斥反应所识别的耙抗原主要是表达于移植物细胞表面的MHC分子，MHC在移植中具有重要的作用，器官移植后发生急性排斥反应时宿主MHC有何变化?这方面很少有人研究，由于外周血比较容易检测，因此我们以外周血单个核细胞MHC代表宿主MHC来研究急性移植排斥反应时宿主MHC变化，希望能找到更好的移植排斥检测指标。本实验研究新西兰白兔皮肤移植后外周血单个核细胞表面MHC的变化，由于急性移植排斥反应和感染都可导致MHC异常，所以本实验也研究了新西兰白兔感染时外周血单个核细胞表面MHC的变化。选择新西兰白兔为动物模型，是由于动物相对较大，便于多次抽血连续观察，因此我们选用新西兰白兔作为动物模型，进行不同类型兔的同种异基因皮肤移植，相对于内脏器官移植来说，皮肤的移植排斥反应容易及时观测。以新西兰白兔自体皮肤移植作为实验对照，不同类型兔的皮肤移植作为实验组，观察外周血单个核细胞表面MHC的变化。新西兰白兔感染的研究我们以绿脓杆菌为代表，研究了新西兰白兔皮下注射绿脓杆菌后外周血单个核细胞表面MHC的变化。外周血单个核细胞MHC基因表达与早期急性移植排斥的实验研究中，15只新西兰白兔随机分为三组，3只自体皮肤移植为对照组，实验1组和实验2组各6只做同种异基因皮肤移植，实验1组术前1天及术后每天肌注环孢素(5m g／kg)。术后实验1组和实验2组应用抗生素预防感染，观察移植皮肤发生排斥时间，隔天抽外周血提取单个核细胞，应用实时定量PCR仪测定MHCⅠ和MHCⅡ基因mRNA的表达，皮肤移植3后隔天取全层皮片进行病理检查。对照组即自体皮肤移植组，皮片生长良好，皮片颜色和硬度始终正常，未见急性排斥反应(AGR)。实验1组和实验2组于AGR发生前2天左右真皮散在单核细胞浸润，发生急性排斥时真皮可见较多淋巴细胞和单核细胞浸润，未见中性粒细胞浸润，证实发生急性排斥反应，并且没有术后感染。同种异体移植皮片发生排斥时间：肌注环孢素的实验1组为(7.75±0.72)天，未用环孢素的实验2组为(6.57±0.53)天。MHCⅠ和MHCⅡ基因mRNA相对定量表达结果表明，对照组移植前后MHCⅠ和MHCⅡ基因mRNA表达均没有明显变化。MHCⅠ基因mRNA表达在应用免疫抑制剂组呈上升趋势，但上升缓慢，到肉眼可见排斥时，达到最高值，未用免疫抑制剂组表达变化不明显。MHCⅡ基因mRNA表达在应用免疫抑制剂和未用免疫抑制剂组表达趋势基本一致，即在肉眼可见排斥反应前2-3天达迅速达到最高值，随后下降。急性排斥反应发生于移植术后数天至2周左右，以细胞免疫为主，CD4和CD8 T细胞被活化激活。外周血单个核细胞主要是淋巴细胞，其中大部分是T细胞。对上述MHCmRNA表达在皮肤移植后迅速增高可能的解释是，当发生急性排斥时，淋巴细胞被活化，细胞免疫和体液免疫增强，从而使外周血单个核细胞的MHCmRNA表达增高，相应的MHC类分子表达也增高。另外我们也检测了绿脓杆菌感染后血常规和MHC基因mRNA表达的变化。8只新西兰白兔随机分成两组，对照组3只，实验组5只。实验组5只新西兰白兔于实验前1天皮下注射绿脓杆菌，绿脓杆菌浓度为5×10~9CFU。对照组3只新西兰白兔实验前1天皮下注射相同体积的生理盐水。实验持续8天。术后每2天无菌抽取实验兔外周血1ml，先检测血常规，剩余抗凝血用于分离外周血单个核细胞，应用实时定量PCR仪测定MHCⅠ和MHCⅡ基因mRNA的表达。结果表明：对照组注射前后白细胞总数和中性细胞数没有明显变化。实验组注射绿脓杆菌后白细胞总数和中性细胞数明显升高。对照组注射前后PBMC MHCⅠ和MHCⅡmRNA表达无明显变化。实验组注射绿脓杆菌后PBMC MHCⅠ和MHCⅡmRNA表达较对照组明显升高。细菌感染目前临床上已经很容易发现和检测，血常规中白细胞总数、中性细胞数和中性细胞数的比率升高反应急性细菌感染。而急性移植排斥反应发生时，对照组、实验1组和实验2组实验前后血常规中白细胞总数和中性细胞数无明显变化。因此我们认为，利用外周血单个核细胞MHC基因mRNA表达检测急性排斥反应同时，检测血常规，如果血常规没有明显的白细胞总数、中性细胞数和中性细胞数的比率升高，而外周血单个核细胞MHC基因mRNA表达升高时，可以排除细菌感染引起的MHC基因mRNA表达升高，诊断为急性移植排斥。由于大部分病毒尤其是巨细胞病毒感染后，外周血单个核细胞表面表达MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ分子降低，这样如果检测到MHC基因mRNA表达升高，基本可以排除病毒感染，诊断为急性移植排斥。由于MHC分子极为丰富的多态性，制备相应的抗体十分困难。而实时定量RT-PCR是一种快速、准确和高度敏感的实验方法，我们知道MHC具有丰富的多态性，过去的研究难点是由于MHC分子的高度多态性而不能进行MHC分子的mRNA定量，我们首次在MHC的保守区做文章，设计跨保守区的引物，这样就能很容易的进行MHC分子的mRNA定量，这是我们创新性的一个亮点。另外，外周血单个核细胞分离比较容易。以上结果显示，外周血单个核细胞MHCmRNA表达可以考虑作为一种早期无创伤性的移植排斥检测指标，它在肉眼可见排斥反应前2-3天即皮肤移植排斥病理Ⅰ级时就呈明显上升趋势，早于目前已知排斥指标，特别是早于目前临床上的实质脏器功能指标，这样利用外周血单个核细胞MHC mRNA表达可以及时早期检测器官移植后的排斥反应，避免脏器功能损害。但是本实验是以看家基因β-actin作为内参来研究mRNA表达的变化，定量的标准和方法没有标准化，是其不足，以后的研究中应寻求更完善的mRNA表达方法。环孢素和糖皮质激素药物强的松是临床普遍应用的免疫抑制剂。环孢素是否能降低MHC基因的表达?各家说法不一，有的文献指出，环孢素能减少MHC基因的表达，而最近Lim SW则指出环孢素增加MHC基因的表达。环孢素对宿主MHC基因的表达有何影响?我们以新西兰白兔进行动物实验，研究新西兰白兔肌肉注射环孢素后外周血单个核细胞和宿主脏器(肝脏、脾脏、肾脏和胸腺)MHC分子基因表达变化情况，实验连续30天，来检测环孢素对宿主MHC基因表达的影响。糖皮质激素降低MHC基因的表达，这早有报道，但是以往没有系统全面的研究。我们这次是检测新西兰白兔服用强的松后，外周血单个核细胞和宿主多个脏器(肝脏、脾脏、肾脏和胸腺)MHC分子基因表达变化情况。在环孢素影响宿主MHC基因表达的实验中，13只新西兰白兔随机分成三组，对照组3只，低剂量环孢素组5只，大剂量环孢素组5只。低剂量环孢素组每天肌肉注射环孢素(5m g／kg)，大剂量环孢素组每天肌肉注射环孢素(20m g／kg)，对照组3只新西兰白兔每天肌肉注射相同体积的生理盐水。实验持续30天。实验开始前和实验结束时抽血，测定谷丙转氨酶、谷草转氨酶、尿素氮和血肌酐。每隔5天无菌抽取实验兔外周血1ml，分离单个核细胞，应用实时定量PCR仪测定MHCⅠ和MHCⅡ基因mRNA的表达。第30天实验结束取实验新西兰白兔肝脏、脾脏、肾脏和胸腺少许，应用实时定量PCR仪测定MHCⅠ和MHCⅡ基因mRNA的表达。实验30天结束时，大剂量环孢素组新西兰白兔谷丙转氨酶：实验前平均35IU/L，实验结束时平均73IU/L；谷草转氨酶：实验前平均38IU／L，实验结束时平均78IU／L；尿素氮：实验前平均6.13mmol/L，实验结束时平均21.72mmol／l；血肌酐：实验前平均62μmol／L，实验结束时平均274μmol／L。低剂量环孢素组(5m g／kg)和对照组实验前后没有明显变化。实验30天结束时，对照组和低剂量环孢素组新西兰白兔肝脏和肾脏病理检查无明显变化。大剂量环孢素组新西兰白兔肝脏呈急性环孢霉素中毒，包括肝内胆管淤胆、肝血管内红细胞增多和肝细胞气球样变性。大剂量环孢素组新西兰白兔肾脏呈急性环孢霉素中毒，包括管周毛细血管红细胞增多和近端肾小管上皮细胞等立方的空泡变性。以上血生化和病理检查证明大剂量环孢素(20m g／kg)已造成实验兔肝脏和肾脏损，所应用的环孢素剂量(20m g／kg)确实是大剂量。MHC分子mRNA表达结果表明，低剂量环孢素组和大剂量环孢素组外周血单个核细胞MHCⅠ和MHCⅡ表达在5-10天时呈显著上升趋势，15天后直到30天实验结束，MHCⅠ和MHCⅡ表达又下降到最初用药前水平。实验30天结束时宿主脏器(肝脏、脾脏、肾脏和胸腺)MHCⅠ和MHCⅡ表达没有明显变化。我们的实验结果和Lim SW的一样，应用环孢素后能增加MHC基因的表达。但这种增加是一过性的，只是在应用环孢素的第5-10天左右，随着用药时间延长，并不能连续增加MHC基因的表达。宿主各脏器应用用环孢素后，可能也是一过性地增加MHC基因的表达，由于我们是在实验结束时取各脏器测定，它们的升高趋势已经结束，因此与对照组相比无明显变化。环孢素抑制排斥反应是因为环孢素与胞内的环孢亲和素结为复合体，后者与钙调磷酸酶结合并抑制其酶活性，通过抑制胞浆NT-AT向胞核内移动，而干扰IL-2转录，最终阻断IL-2依赖性T细胞生长和分化。我们的实验表明，环孢素能一过性增加MHC基因的表达，可能的原因是环孢素引起某些细胞因子的升高，需要以后来证明。这是第一次提出关于环孢素能一过性增加MHC基因表达的结论。糖皮质激素作为免疫抑制药物用于临床器官移植的历史已经很长。目前认为它的作用机制是抑制移植免疫活性细胞在“识别阶段”向移植器官集聚并使其裂解，阻止了它们对移植器官上免疫抗原的识别。我们以新西兰白兔进行动物实验，应用实时定量RT-PCR的方法，系统全面研究新西兰白兔服用大剂量强的松后外周血单个核细胞和机体各脏器MHC分子mRNA表达变化情况。8只新西兰白兔随机分成两组，实验组5只，对照组3只。实验组5只新西兰白兔每天用理盐水溶解的强的松(20m g／kg)灌胃，对照组3只新西兰白兔每天以相同体积的生理盐水灌胃。实验组和对照组新西兰白兔连续灌胃8天。第4天和第8无菌抽取实验兔外周血1ml，分离单个核细胞，应用实时定量PCR仪测定MHCⅠ和MHCⅡ基因mRNA的表达。第8天实验结束取实验新西兰白兔肝脏、脾脏、肾脏和胸腺少许，应用实时定量PCR仪测定MHCⅠ和MHCⅡ基因mRNA的表达。结果表明：外周血单个核细胞MHCⅠ基因表达在第4天和第8天明显降低，MHCⅡ基因mRNA表达用药后第4天下降，第8天明显降低；宿主各脏器包括肝脏、脾脏、肾脏和胸腺用药结束后MHCⅠ和MHCⅡ基因mRNA表达均较对照组降低。相比较而言，外周血单个核细胞在用药结束后MHCⅠ和MHCⅡ基因mRNA表达降低比宿主各脏器更明显。Giuliani C研究表明，糖皮质激素降低大鼠胸腺MHCⅠ基因表达。更早的研究表明，强的松抑制小鼠巨噬细胞MHCⅡ基因表达。我们的研究表明，糖皮质激素药物强的松能广泛降低宿主各脏器MHCⅠ和MHCⅡ基因mRNA表达，而降低外周血单个核细胞MHCⅠ和MHCⅡ基因mRNA表达更明显。因此认为可以用外周血单个核细胞代表宿主各脏器来研究宿主应用糖皮质激素后的变化情况。既然强的松能广泛降低宿主各脏器MHC基因mRNA表达，那么宿主进行器官移植后，移植器官作为宿主机体的一部分，糖皮质激素药物强的松也应该能降低移植器官脏器的MHC基因mRNA表达。这样看来，强的松能降低移植排斥反应所识别的靶抗原，也就是表达于移植物细胞表面的MHC基因mRNA表达，从而能部分有效地抑制急性移植排斥反应。