研究背景： 周围神经损伤修复术中，最理想的是能做到相同性质的神经束能进行对接，但无论是显微解剖的图谱还是组织化学染色的切片，都是孤立的二维断面，缺乏连续性和在复杂临床环境下的定位指导性，其主要原因是不能形象地反映神经在其全长的内部结构中神经束的连续性及其变化规律，难以满足手术中结合部位随机对照调整以进行精确的神经功束组吻合修复的要求。近年来计算机技术的飞速发展提供了平面图像三维构建的可能。此前，国内外目前有关神经内部形态结构的三维重建尚处起步阶段。 本研究着眼于此，拟对周围神经三维重建过程中实验室关键技术、全景标准化图像获取及连续组织切片的计算机自动图像配准和轮廓提取、分割等关键技术路线进行研究；并验证Amira等第三方三维重建软件重建的可适性，进一步整合二维及三维软体平台，为实现周围神经内部结构三维重建的计算机自动化提供医学背景和技术参考，进而确立一整套成熟标准的技术路线，为海量切片构建周围神经可视化数字模拟系统数据库提供现实可行的方法。 目的： 1.基于周围神经组织包埋剂包埋超薄冰冻切片技术，以4根成年女性头发作为标志线，固定于神经四周，分别以普通玻片及防脱多聚赖氨酸涂层硅化玻片为载体贴片及AChE及HE染色，观察不同贴片载体及不同染色方法下头发标志线的贴片情况，比较分析各组间头发标志线染色前、后的贴片率，以评估一次性获取染色后带完整标志定位点的神经二维图像的可行性。 2.基于周围神经切片的Kamovsky—Roots铁氰化铜法乙酰胆碱酯酶染色方法，通过对比神经断面染色切片光学扫描仪扫描、显微镜下分区摄像拼接和高像素全景数码成像装置一次性全景成像获得的数字化神经断面全景二维图像的特点，以评估全景数码成像用于神经功能束三维重建的可行性，以简化拼接等中间程序，减少系统误差，从而解决重建中神经断面全景二维图像获取的关键技术问题。 3.基于周围神经断面全景数码成像技术并结合Photoshop二维图像处理软件，尝试开发神经断面二次成像及合成处理技术，以获取含有4个配准标志点的完整信息的神经二维断面全景图像，以解决切片染色过程中配准标志点的丢失这一二维图像制备中的关键难题。 4.联合广东工业大学自动化学院，基于含完整标志点的周围神经切片功能束Karnovsky—Roots铁氰化铜法乙酰胆碱酯酶染色二维图像特点，尝试开发医学二维图像配准及轮廓获取、图像分割等软件，以期实现二维图像的自动配准及不同信息的分割获取，减少手工操作，提高重建精度及效率，以解决三维重建前二维图像前期处理中的关键性技术问题。 5.在以上关键技术流程的基础上，利用市售第三方医学三维重建软件(Amira软件)进行上臂20cm长尺神经功能束三维重建，观察重建效果，评估软件重建可适性，并开发任意角度虚拟切割算法，以验证三维重建的逆向还原真实度；同时通过对上臂长段尺神经功能束三维重建，观察其功能束的变化规律，为临床臂丛神经损伤相关术式(Oberlin术式等)提供可视化直观的解剖学依据。 材料和方法： 1.新鲜成人截肢坐骨神经标本，以4根成年女性头发作为标志线，固定于神经四周，横断面连续冰冻切片100张，片厚10μm，随机分为4组，每组25张切片，分别以不同玻片载体(多聚赖氨酸涂层防脱硅化玻片贴片和普通玻片)贴片及不同染色方法(HE染色及Karnovsky—Roots法AChE组织化学染色)每组染色前、后均以Z61型体视显微镜+MSHOT MD90显微数码成像装置一次性全景数码成像，明美图像采集软件进行图像采集，ACDSEE Pro2视图软件进行图形分析及标志点计数，比较各组间及染色前后人发标志线粘附情况。 2.新鲜成人截肢腓总神经标本冰冻切片，Karnovsky—Roots铁氰化铜法AChE组织化学孵育24小时，分别以100×光学显微镜下分区数码拍照后Autositch拼接软件拼接获取神经断面全景图像和高分辨率光学扫描仪扫描及OLYMPUS数码全景成像仪一次性获取神经断面全景图像，对比3组图像的神经功能束生理信息完整性、神经束轮廓清晰度等指标。 3.新鲜成人截肢坐骨神经标本，四条女性头发丝标志线OCT二次包埋，横断面连续冰冻切片，片厚15μm，普通玻片贴片，采用二次成像技术，即用900万像素OLYMPUS数码全景成像仪于AChE染色前和组织化学孵育24小时后分别获取同一切片的两张全景图像，比较两张图像神经轮廓吻合度，通过PhotoshopCS2图层叠加和合并功能进行图像处理，以获取含完整4个定位标志点的神经断面二维全景图像。 4.基于含4个标志点的坐骨神经切片功能束AChE染色二维图像特点，开发模式识别中先进的优化最小二乘支持向量机方法(optimized least square support vector machine，Optimized LS—SVM)作为分类器结合计算机图形学中的拉伸与平移，对图像进行处理，利用外控制点配准神经切片图像。对于二维图像的功能束边缘获取，尝试采用改进k—均值聚类方法及像素点“蚕食”的方法获取神经束边界，完成二维图像的配准及分割计算机算法设计。 5.基于上述神经连续切片AChE组织化学染色二维全景图像获取、计算机自动配准和分割的技术操作流程，以上臂腋窝至肱骨髁间连线平面25cm尺神经为研究对象，通过Amira医学三维重建软件进行长段尺神经功能束三维重建，评估重建逆向还原效果及重建软件可适性，分析上臂尺神经功能束走行及变化规律。 结果： 1.不同玻片载体及不同染色方法染色后100张切片人发标志点脱失均较严重，仅发现4个标志点完整的图像1例，多数完全丢失或仅残留1个标志点，另有部分介于2～3个点之间，部分标志点移位明显。各组间人发在玻片上存留的数量级别无明显差异(P>0.05)；染色前100张图像具完整的4个人发标志点的有98张，完整粘附率达98.00％，总体粘附率为99.50％，而染色后100张图像的人发完整粘附率为1％，总体粘附率为22.50％，染色前后人发标志点数量有显著性差异(P<0.01) 2.AChE染色切片扫描图像属一次性全景成像，成像快捷方便，但轮廓欠清晰，且无法根据图像本身进行神经束性质鉴别，实际应用中需要对照镜下图像对每张图像进行逐张、逐个神经束的功能性质鉴别；100倍光学显微镜下定焦分次摄影拼接而成的二维全景图像属分次全景成像，神经束轮廓清晰，图像包含了可染色的神经纤维功能性质的全部生理信息，可直接在图像上进行明确的神经束功能性质鉴别；高像素全景数码成像装置可一次全景成像，变形细微，神经束轮廓清晰，功能束区分明显易于鉴别，基本具备高倍光学显微镜下拼接图像的特点。 3.神经断面切片染色前照片人发标志点完整贴片率很高，位置准确，能满足配准的要求，利用PHOTOSHOP图层合并功能处理同一张切片染色前后的图像，图像轮廓吻合度良好，合成图像获得的标志点定位精确，而且整个操作过程简单快捷。 4.采用模式识别中先进的优化最小二乘支持向量机方法(optimized least square support vector machine，Optimized LS—SVM)作为分类器结合计算机图形学中的拉伸与平移，利用外控制点配准神经切片图像，配准精确度高，误差率只有8.25％；采用粗糙k—均值聚类法和像素点“蚕食”的方法获取的神经边缘完整，信息丢失少，边缘圆润，但需调高图像灰度才能获得较好的提取效果，增加了功能束性质的鉴别困难。 5.应用Amira3.1基于神经连续组织切片自动配准+人工辅助轮廓获取可实现上臂长段尺神经内部功能束的三维重建。重建的20.0cm长的尺神经内部功能束的三维结构，可直观的观察到神经内部不同性质功能束交叉融合的变化，并可以单独提取、合并或任意组合显示，还可在矢状轴、冠状轴、水平轴进行剖切和任意角度旋转观察，其中同一通道的轮廓和走行渐变功能可辅助纠正神经切片的变形，升级的版本还具有标尺参数后的数据测量功能及任意角度斜切的功能。结合400张尺神经断面切片和重建三维模型的观察，发现人体上臂尺神经内部功能束有如下特点：①功能束以运动和感觉的混合束为主，②功能束间交叉融合非常频繁，至中上1/3段分束最多；③神经束自腋窝段至上臂中段开始逐渐集中，在上臂中段3cm范围内完成2次完全融合。 结论： 1.人发作为周围神经超薄冰冻组织切片标志点染色后贴片率较低，不能满足目前配准软件的算法要求。 2.染色前结晶状态下的周围神经切片标本人发标志点完整贴片率很高，基于同一张切片AChE染色前后二次成像技术和Photoshop图层处理技术，可获取具备完整定位标志点周围神经二维全景图像，可解决三维重建前配准标志点的获取的关键技术问题。 3.体视全景数码成像仪高像素一次性全景数码成像为神经功能束三维重建获取全景二维图像较好的方法。 4.基于含4个标志点优化最小二乘支持向量机方法+外控制点配准算法自动配准神经断面图像，精确度高，可应用于三维重建。 5.粗糙k—均值聚类方法及像素点“蚕食”方法获取神经束边界的算法需改变神经灰度以获取较好效果，需进一步改进。 6.Amira三维重建软件功能强大，适合于周围神经功能束的三维可视化重建，但还需人工辅助识别功能束性质。 7.上臂尺神经以混合束为主，束支交叉融合复杂，在上臂中上1/3分束最多，在上臂中段上下分别完成2次完全融合。