MiR-499-5p是在骨骼肌中特异性表达的microRNA，Sox6是调控肌肉发育的转录因子，它们都能调控肌纤维类型的形成与转化。本研究旨在克隆猪Sox63UTR序列，并探讨miR-499-5p能否靶向Sox6调节猪骨骼肌慢肌纤维的形成。本研究共包括以下三个试验:
　　试验一猪Sox63UTR序列的扩增
　　本研究根据猪Sox6编码区序列(GenBank登录号为KF933861)和预测的猪Sox6mRNA序列（GenBank登录号为XM_013994541），设计特定引物，以猪背最长肌RNA为模板扩增得到猪Sox63UTR序列。连接T载体后将阳性菌落进行测序，结果发现克隆的序列全长为2012bp，包含500bp猪Sox6编码区序列和1512bp3UTR序列，提交至GenBank后获得登录号为KJ123704。对序列进行分析发现，该序列中存在8个可与miR-499-5p种子序列（5端第2-7个碱基）互补配对的潜在结合位点。
　　试验二猪Sox6为miR-499-5p靶基因的鉴定
　　本研究以pMD19-T-pSox63UTR质粒为模板，采用定点突变的方法将预测的miR-499-5p的潜在结合位点全部突变，进行双荧光素酶报告基因分析，结果显示，在miR-499-5p mimics（模拟物）分别与猪Sox63UTR野生型和突变型重组质粒共转染组中，荧光素酶活性倍数均显著降低，表明在预测的8个靶位点之外可能还存在其他的结合位点。随后扩增含有第一个miR-499-5p潜在结合位点、长度为276bp的序列，再次进行定点突变和双荧光素酶报告基因分析，结果显示，在转染野生型猪Sox63UTR重组质粒的细胞中，miR-499-5p模拟物组的荧光素酶活性倍数显著降低，仅为对照组的66.4％;而在转染突变型猪Sox63UTR重组质粒的细胞中，miR-499-5p模拟物组与对照组相比，无统计学差异，由此证实猪Sox6为miR-499-5p的靶基因。此外，实时荧光定量PCR发现，猪EDL与SOL肌肉中miR-499-5p和猪Sox6mRNA的表达呈相反规律。
　　试验三MiR-499-5p对猪骨骼肌慢肌纤维形成的调控及其机理
　　本研究采用酶消化法从3日龄DLY仔猪的背最长肌中成功获得猪骨骼肌卫星细胞，用脂质体Lipofectamine3000将100nM的miR-499-5p mimics/miRNAmimics Negative Control和200nM的miR-499-5p inhibitor/miRNA inhibitor Negative Control分别转染到分化24h后的猪骨骼肌卫星细胞内，继续培养3d后利用实时荧光定量PCR与Western blot分析检测相关基因和蛋白质的表达。结果显示，在转染miR-499-5p模拟物的细胞中，猪Sox6mRNA的表达量下降了78.3％，而在转染miR-499-5p抑制剂的细胞中，猪Sox6mRNA的表达量则显著上调了2.77倍，证实miR-499-5p能够抑制Sox6基因的表达;此外，与对照组相比，转染miR-499-5p模拟物使MyHCⅠ与MyHCⅡa mRNA的表达量分别提高了17.8倍和11.3倍，Slow myosin heavy chain(慢型肌球蛋白重链，即MyHCⅠ)和P-AKT蛋白表达量显著提高，表明miR-499-5p能够促进慢肌纤维的形成。本试验证实miR-499-5p可通过抑制Sox6的表达来促进猪骨骼肌慢肌纤维的形成，这一调控过程可能与AKT的激活有关。
　　总之，本研究成功克隆了猪Sox63UTR序列，证实猪Sox6为miR-499-5p的靶基因，并证实miR-499-5p可通过抑制Sox6的表达促进猪骨骼肌慢肌纤维的形成。