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疫苗接种是预防和控制传染性疾病最经济、有效的手段。佐剂是传统疫苗和新型疫苗必不可少的组成成分,不仅影响机体对疫苗的适应性免疫应答的强度,而且能针对特定病原体诱导最有效的免疫应答类型。目前研究报道的免疫佐剂种类很多,但由于存在毒副作用或安全隐患等不可避免的缺陷而难以实际应用。皂苷(saponin)是一类广泛存在于天然药物中具有免疫活性的重要物质。自1951年发现皂苷能增强机体对口蹄疫疫苗的免疫应答以来,其佐剂作用受到广泛的关注。土贝母(Bolbostemmatis Rhizoma),是葫芦科植物土贝母Bolbostemma paniculatum(Maxim.)Franquet的干燥块茎。作为一种传统中药,土贝母对炎症、疣、肿瘤等多种疾病具有疗效。土贝母含三萜皂苷、生物碱、多酚、黄酮醇、甾醇等生物活性物质。三萜皂苷——土贝母苷(tubeimoside,TBMS)被认为是土贝母的主要活性成分之一,为苷元的C-3和C-28位的二个糖基侧链通过3-羟基-3-甲基戊二酸(hydroxy-3-methyl glutaric acid)形成结构独特的环双糖链皂苷,具有广泛的生物学和药理活性。鉴于TBMS的独特的化学结构,其可能具有潜在的佐剂活性。本课题即以小鼠为实验动物,以卵清白蛋白(Ovalbumin,OVA)为模式抗原,研究土贝母中一种主要皂苷成分TBMS I的佐剂活性,并探索了TBMS I佐剂作用的先天性免疫机制,为其作为新型佐剂的开发研究提供科学依据。1.土贝母苷甲的免疫佐剂活性以Quil A为阳性对照,土贝母苷甲(TBMS I)不同剂量联合OVA皮下注射免疫小鼠,首免两周后加强免疫,二免两周后分离血清和制备脾脏单细胞悬液。采用ELISA检测免疫小鼠血清中OVA特异性IgG及其亚类IgG1、IgG2a和IgG2b抗体效价;MTT法检测脾细胞增殖反应和自然杀伤(Nature killer,NK)细胞活性;ELISA检测试剂盒分析免疫小鼠特异性抗原刺激脾细胞培养上清中细胞因子含量;qRT-PCR检测免疫小鼠特异性抗原刺激脾细胞细胞因子和转录因子基因表达水平。以此评价对OVA受免小鼠体液免疫和细胞免疫应答的佐剂活性。TBMS I可显著提高受免小鼠血清中OVA特异性IgG及其亚类IgG1、IgG2a和IgG2b抗体效价(P<0.05,P<0.01或P<0.001);增强Con A、LPS和OVA蛋白刺激的受免小鼠脾细胞的增殖反应(P<0.05,P<0.01或P<0.001)以及NK细胞的杀伤活性(P<0.01或P<0.001)。TBMS I显著促进受免小鼠脾细胞分泌Th1和Th2型细胞因子的能力;上调受免小鼠脾细胞Th1/Th2型细胞因子和转录因子的mRNA表达水平。同时,迟发型超敏反应(DTH)实验结果显示:与单独OVA免疫组相比,TBMS I可显著提高受免小鼠对OVA的DTH反应。这些结果说明:TBMS I能显著增强受免小鼠OVA特异性体液免疫和细胞免疫应答,并能同时诱导Th1和Th2应答反应,可作为疫苗的候选佐剂。2.土贝母苷甲佐剂作用的先天性免疫机制研究以Alexa Flour 488 conjugated OVA(OVA-AF488)为抗原,单独或联合TBMS I股四头肌肌内注射C57BL/6J小鼠,于注射后12、24、48 h,收集股四头肌和引流淋巴结,制备单细胞悬液,采用荧光标记特异性抗体组合染色,流式细胞仪分析各种类型免疫细胞的募集动力学变化和摄取抗原的主要细胞类群。对于注射部位的基因表达和细胞因子分泌水平分析,TBMS I或PBS股四头肌注射C57BL/6J小鼠,于注射后2、4、6 h收集股四头肌,TRIzol匀浆后提取总RNA,采用qRT-PCR检测细胞因子和趋化因子基因表达水平;于注射后3、6、12 h收集股四头肌,ELISA试剂盒和Western-Blot方法检测细胞因子及趋化因子蛋白表达水平。结果表明:与单独OVA免疫相比,TBMS I可显著募集中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树状细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞到注射部位,并增强这些免疫细胞在注射部位和引流淋巴结中对OVA-AF488的摄取能力。TBMS I肌内注射可上调注射部位局部组织细胞因子和趋化因子基因表达水平,诱导局部组织产生细胞因子和趋化因子。这些结果说明:TBMS I可诱导注射部位局部组织释放细胞因子和趋化因子,募集免疫细胞到注射部位,改变免疫微环境,从而促进适应性免疫应答。综上所述,TBMS I对OVA具有免疫佐剂活性,能促进免疫小鼠抗原特异性体液免疫和细胞免疫应答,且能同时诱导Th1/Th2免疫应答。其机制可能系通过诱导注射部位局部组织释放细胞因子和趋化因子,募集免疫细胞,改善局部免疫微环境,促进免疫细胞摄取抗原,从而增强适应性免疫反应。