1.背景与目的：血管内皮损伤是动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)和经皮冠脉介入术(percutaneouscoronary intervention，PCI)后血管再狭窄的一个主要的病理生理基础。因此，内皮的修复和再生成为治疗心血管疾病的关键策略。虽然内皮细胞(Endothelial cells，ECs)通常被认为只有依靠邻近成熟ECs才能被修复和再生。然而，由于ECs属于终末分化细胞，增殖能力较低，极大地限制了其在治疗上的应用。内皮祖细胞(Endothelial precusor cells， EPCs)是一种特殊类型的骨髓祖细胞，是血管ECs的前体细胞。它能够进入循环，增殖并分化为ECs，但尚未表达成熟血管ECs表型，也未形成血管。EPCs是包括了从血管母细胞到成熟ECs之间多个阶段的细胞。修复血管内皮主要和早期EPCs密切相关；而晚期EPCs则随着其增殖能力的增强，在血管生成中发挥作用。既往的许多基础和临床研究已经证实EPCs可以归巢到血管损伤的部位、分化为ECs，进而替代受损伤的内皮。因此，EPCs在出生后缺血组织的血管新生、维持正常内皮功能和修复损伤血管内皮等方面都发挥着极其重要的作用。血小板源生长因子(Platelet-Derived Growth Factor， PDGF)最初从血小板中分离出来。PDGF是由四种不同多肽链(PDGF-A，-B，-C，-D)通过二硫键连接的五种糖蛋白异构体(PDGF-AA，-BB，-AB，-CC，-DD)组成的家族。这五种PDGF二聚体以不同的亲和力和PDGFR-α、PDGFR-β、PDGFR-αβ特异性结合。而作为有着很强的促细胞分裂增殖能力和趋化作用的PDGF–BB，是唯一能与α、β、αβ三种受体亚单位结合的因子。事实上，PDGF-BB或者PDGFR-β和血管增生性疾病，例如AS和PCI后再狭窄的发病机制密切相关。有证据表明，PDGF-BB或PDGFR-β可以促进AS病变形成以及PCI后的血管损伤引起的内膜增生。并且，在动物模型上也观察到使用PDGF或PDGFR的特异性阻滞剂能够抑制动脉内膜损伤后新生内膜的增生。以往的研究表明，PDGF-BB和PDGFR-β之间的相互作用对细胞的增殖和迁移至关重要。我们注意到，PDGF-BB和PDGFR-β的相互作用可以诱导PDGFR磷酸化和激活磷酸肌醇3激酶(phosphoinositide3-kinase，PI3K)。而PI3K信号通路，也同样参与许多细胞进程，包括细胞增殖、存活、运动和血管生成。在损伤血管的ECs再生中，EPCs始终发挥着重要的作用。而基于PDGF-BB和PDGFR-β的生物学功能，我们推测PDGF-BB和PDGFR-β可能和EPCs增殖、迁移和血管生成有潜在的联系，并且能够参与新生血管形成和血管损伤后的修复过程。因此，在本实验中，我们通过过表达PDGFR-β评估PDGF-BB在EPCs增殖、迁移和血管新生中所发挥的作用。此外，我们将过表达PDGFR-β的EPCs通过静脉输注到小鼠体内，观察EPCs介导的血管内皮修复。我们的研究结果旨在为血管损伤的治疗提供一个新的思路。2．方法2.1PDGFR-β在脾源性EPCs的表达2.1.1EPCs培养和鉴定密度梯度离心法获取小鼠脾脏单个核细胞(mononuclear cells，MNCs)，在添加20%优质胎牛血清、VEGF10ng/ml的DMEM/F-12培养液中常规培养。显微镜下观察细胞生长、形态学变化；acLDL-DiI摄取和UEA-I结合实验观察EPCs是否具有ECs功能特性；利用流式细胞仪进行细胞表面干细胞抗原及内皮细胞特异性抗原鉴定。2.1.2PDGFR-β在EPCs的定位和表达2.1.2.1免疫荧光检测PDGFR-β在EPCs的细胞定位2.1.2.2半定量PCR和Western blot检测PDGFR-β在EPCs的表达2.2基因转染脾源性EPCs2.2.1脂质体介导的细胞转染培养10-11天，融合率在60-70%以上的EPCs，利用Lipofectamine2000进行质粒转染。质粒DNA与Lipofectamine2000的比率为1：2。为了观察质粒的转染效率，用激光共聚焦显微镜观察EGFP的荧光表达情况。2.2.2计算转染效率转染效率=EGFP表达阳性细胞数/计数细胞总数。2.2.3半定量PCR和Western blot检测PDGFR-β在EPCs的表达2.3EPCs分泌的PDGF-BB为了比较未转染和转染了过表达PDGFR-β质粒的EPCs分泌PDGF-BB的浓度，我们将培养上清液用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)进行了检测。2.4PDGF-BB对PDGFR-β过表达EPCs生物学功能的影响为了观察转染外源性PDGFR-β和不同浓度的PDGF-BB刺激对EPCs生物学功能的影响，三组转染了PDGFR-β的EPCs(对照组、pEGFP-N2组、pEGFP-N2-PDGFR-β组)分别加入不同浓度的PDGF-BB(0、10、20、40、80，或160ng/ml)。2.4.1PDGF-BB对PDGFR-β过表达EPCs增殖功能的影响用MTS测定EPCs的增殖变化。2.4.2PDGF-BB对PDGFR-β过表达EPCs迁移功能的影响用Transwell小室测定EPCs的迁移。2.4.3PDGF-BB对PDGFR-β过表达EPCs血管生成功能的影响用基质胶测定EPCs体外血管生成能力。2.5探讨PDGFR-β/PI3K/Akt信号通路在PDGF-BB介导的EPCs生物学功能变化中的作用为了评价PDGFR-β/PI3K/Akt信号通路是否参与PDGF-BB介导EPCs的生物学功能，两组EPCs(对照组、pEGFP-N2-PDGFR-β组)在加入最大有效浓度的PDGF-BB前，分别被给予PDGFR-β酪氨酸磷酸化抑制剂AG1295、PI3K信号通路阻断剂LY294002和Akt激酶抑制剂sc-221226预处理1h。2.5.1EPCs增殖功能检测用MTS测定EPCs的增殖变化。2.5.2EPCs迁移功能检测用Transwell小室测定EPCs的迁移。2.5.3EPCs血管生成功能检测用基质胶测定EPCs体外血管生成能力。2.5.4Western blot检测PDGFR-β、PI3K和Akt的磷酸化水平为了观察PDGFR-β/PI3K/Akt信号通路是否参与调控EPCs，在给予PDGF-BB刺激和AG1295、LY294002、sc-221226预处理后，通过Western blot分别检测PDGFR-β、PI3K和Akt的磷酸化水平。2.6PDGFR-β过表达EPCs在血管损伤修复过程中的作用2.6.1建立小鼠颈动脉损伤模型2.6.2PDGF-BB在被损伤血管上的定位和表达2.6.2.1免疫荧光检测PDGF-BB在被损伤血管上的定位2.6.2.2实时定量PCR和Western blot检测PDGF-BB在被损伤血管上的表达2.6.3脾源性EPCs移植小鼠行脾脏切除术后，再行颈动脉损伤。小鼠颈动脉损伤后，通过尾静脉注射EGFP-EPCs或者PDGFR-β-EPCs。24h后再重复注射一次。2.6.4EPCs示踪用激光共聚焦显微镜观察细胞是否归巢到血管损伤的局部，以及是否具有ECs表型。2.6.5EPCs移植对血管再内皮化的影响为了评估血管再内皮化，在损伤后的第7d获取损伤侧颈总动脉，冰冻切片后进行Evans blue染色。2.6.6EPCs移植对血管新生内膜增厚的影响为了评估血管新生内膜厚度，在损伤后的第14d获取损伤侧颈总动脉冰冻切片，进行HE染色。2.6.7PDGFR-β过表达EPCs对损伤后血管内膜细胞凋亡的影响为了检测血管内膜细胞凋亡，在损伤后的第7d获取损伤侧颈总动脉，冰冻切片后进行TUNEL免疫荧光染色。TUNEL的凋亡指数=标记阳性细胞数/总细胞数。3.结果3.1PDGFR-β在脾源性EPCs的表达3.1.1EPCs鉴定3.1.1.1EPCs的形态学特征倒置显微镜观察可见：小鼠脾源性EPCs培养4-7d，呈梭形、纺锤形，具有内皮样细胞形态。同时有细胞集落形成；10d可见细胞首尾相连，呈线状排列；20d可见细胞相互融合，呈铺路石状。3.1.1.2荧光双染鉴定培养4-7d的EPCs，用acLDL-DiI和FITC-UEA-I进行染色。激光共聚焦荧光显微镜下观察，细胞摄取acLDL-DiI呈现红色荧光，结合FITC-UEA-I呈现绿色荧光，acLDL-DiI和FITC-UEA-I双染色阳性细胞呈现黄色荧光，即为双染阳性细胞。这些双染的细胞被认为是正在分化的EPCs。我们实验中培养的EPCs双染阳性细胞数为91.2±1.8%。3.1.1.3分子表面标记表达鉴定利用流式细胞分析技术检测培养7d的EPCs，贴壁细胞表面表达干细胞抗原Sca-1为71.7±0.93%；表达内皮细胞特异性抗原VEGFR-2为52.49±9.27%。3.1.2PDGFR-β在EPCs的定位和表达3.1.2.1免疫荧光检测PDGFR-β在EPCs的细胞定位培养7d的EPCs，通过免疫荧光技术在激光共聚焦显微镜下检测可见：PDGFR-β在培养细胞的细胞膜上阳性表达率为88.6±4.3%，说明PDGFR-β主要定位在EPCs的细胞膜。3.1.2.2半定量PCR和Western blot检测PDGFR-β表达培养4、7、14、21d的EPCs，通过半定量RT-PCR和Western blot检测发现在EPCs有PDGFR-β mRNA和蛋白的表达。而且，随着EPCs分化时间的延长，PDGFR-β mRNA和蛋白的表达逐渐增加，但表达量均呈较低水平。3.2基因转染脾源性EPCs3.2.1通过激光共聚焦显微镜观察：在转染后21h，可以看见被转染的EPCs有EGFP荧光表达；而未被转染的正常EPCs则没有EGFP的荧光表达。3.2.2计算转染效率大概在50-60%。3.2.3在转染后72h，半定量RT-PCR和Western blot检测发现与空白对照组和pEGFP-N2空质粒转染组相比较，pEGFP-N2-PDGFR-β质粒转染组PDGFR-β mRNA和蛋白在EPCs的表达显著增高(P＜0.01)。3.3EPCs分泌的PDGF-BBPDGF-BB是一种分泌蛋白，在EPCs的培养液上清中，它的浓度是17.2±2.0pg/ml。在转染后48h和72h，与空白对照组和pEGFP-N2空质粒转染组相比较，pEGFP-N2-PDGFR-β组EPCs分泌的PDGF-BB浓度显著降低(P＜0.01)。3.4PDGF-BB对PDGFR-β过表达EPCs生物学功能的影响3.4.1PDGF-BB对PDGFR-β过表达EPCs增殖功能的影响PDGF-BB能够显著促进EPCs的增殖。在对照组和空白质粒组，其最大效应发生在20ng/ml；在过表达PDGFR-β组，其最大效应发生在80ng/ml。3.4.2PDGF-BB对PDGFR-β过表达EPCs迁移功能的影响PDGF-BB能够显著促进EPCs的迁移。在对照组和空白质粒组，其最大效应发生在20ng/ml；在过表达PDGFR-β组，其最大效应发生在80ng/ml。3.4.3PDGF-BB对PDGFR-β过表达EPCs血管生成功能的影响PDGF-BB能够显著促进EPCs的血管新生。在对照组和空白质粒组，其最大效应发生在20ng/ml；在过表达PDGFR-β组，其最大效应发生在80ng/ml。3.5PI3K/Akt信号通路在PDGF-BB介导的EPCs生物学功能变化中的作用3.5.1EPCs增殖能力检测经过AG1295、LY294002，或sc-221226预处理，PDGF-BB诱导EPCs增殖无论是在对照组(PDGF-BB20ng/ml)还是在过表达PDGFR-β组(PDGF-BB80ng/ml)均被显著抑制。结果表明，PI3K/Akt信号通路参与了PDGF-BB诱导的EPCs增殖。3.5.2EPCs迁移功能检测经过AG1295、LY294002，或sc-221226预处理，PDGF-BB诱导的EPCs迁移无论是在对照组(PDGF-BB20ng/ml)还是在过表达PDGFR-β组(PDGF-BB80ng/ml)均被显著抑制。结果表明，PI3K/Akt信号通路参与了PDGF-BB诱导EPCs迁移。3.5.3EPCs血管生成功能检测经过AG1295、LY294002，或sc-221226预处理，PDGF-BB诱导EPCs管型生成无论是在对照组(PDGF-BB20ng/ml)还是在过表达PDGFR-β组(PDGF-BB80ng/ml)均被显著抑制。结果表明，PI3K/Akt信号通路参与了PDGF-BB诱导EPCs血管生成。3.5.4Western blot检测PDGFR-β、PI3K和Akt的磷酸化水平经过AG1295、LY294002，或sc-221226预处理后，PDGF-BB诱导EPCs的PDGFR-β、PI3K和Akt磷酸化蛋白活化水平减弱。3.6PDGFR-β过表达EPCs在血管损伤修复过程中的作用3.6.1小鼠颈动脉损伤模型的建立小鼠颈动脉损伤模型成功建立。HE染色证实：在颈动脉损伤后7d，镜下出现可见的内膜增生；在颈动脉损伤后28d，新生内膜明显增生。3.6.2PDGF-BB在被损伤的血管上的定位和表达3.6.2.1免疫荧光检测PDGF-BB在被损伤血管上的定位通过免疫荧光技术在激光共聚焦显微镜下检测可见：在被损伤血管局部的内膜和中膜，有PDGF-BB表达。但是在正常血管则很少有PDGF-BB表达。3.6.2.2实时定量PCR和Western blot检测PDGF-BB在被损伤血管上的表达PDGF-BB mRNA和蛋白在正常血管组织低表达；血管损伤后4d内表达变化不显著；7d表达迅速上升达到高峰；之后逐渐下降，损伤后第21d基本恢复正常水平。3.6.3EPCs示踪EPCs移植后24h，通过激光共聚焦荧光显微镜可以在损伤血管局部观察到携带绿色荧光的EGFP细胞。移植后10d，损伤血管部位可见vWF染色阳性，提示EPCs可归巢于损伤血管部位，分化为ECs，直接参与损伤血管内皮的修复。3.6.4PDGFR-β过表达EPCs对损伤后血管再内皮化的影响通过Evans blue染色观察发现，假手术对照组内皮无损伤，内皮覆盖率为100%，而损伤组残留内皮覆盖率为0%，说明内皮剥脱完全。PDGFR-β过表达EPCs明显促进第7d损伤血管的再内皮化，与相同时间点EGFP-EPCs移植组比较有显著差异(P<0.05)，说明PDGFR-β过表达EPCs对损伤血管早期的再内皮化有促进作用。3.6.5PDGFR-β过表达EPCs对损伤后血管内膜增生的影响在血管损伤后第14d，PDGFR-β过表达EPCs移植组血管组织内、中膜比值明显低于EGFP-EPCs移植组的内、中膜比值(P<0.05)。说明过表达PDGFR-β EPCs抑制了小鼠颈动脉损伤后血管新生内膜的增厚。3.6.6PDGFR-β过表达EPCs对损伤后血管中膜细胞凋亡的影响在血管损伤后第7d，PDGFR-β过表达EPCs移植组中膜细胞TUNEL凋亡指数明显大于EGFP-EPCs移植组(p<0.01)。说明PDGFR-β过表达EPCs对损伤血管早期的中膜细胞凋亡有促进作用。4．结论：4.1小鼠脾脏中含有EPCs，在一定培养条件下可向内皮样细胞分化；4.2PDGFR-β在小鼠脾源性EPCs呈低表达，主要定位于细胞膜；4.3PDGF-BB可促进EPCs的增殖、迁移和血管生成；4.4过表达PDGFR-β通过PI3K/Akt信号通路促进PDGF-BB诱导EPCs增殖、迁移和血管生成；4.5过表达PDGFR-β EPCs显著促进小鼠颈动脉损伤早期血管再内皮化；4.6过表达PDGFR-β EPCs抑制了小鼠颈动脉损伤后血管新生内膜的增厚；4.7过表达PDGFR-β EPCs显著促进小鼠颈动脉损伤早期血管中膜细胞凋亡。