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羊肠道病毒（Caprine enterovirus,CEV）是小RNA病毒科（Picornaviridae）,肠道病毒属（Enterovirus）G种肠道病毒的成员,CEV是一种新发病原。从2012年首次在匈牙利报道至今,日本、泰国、中国、英国、德国等5个国家也报道了CEV。已证实我国吉林、内蒙古、河南、河北、青海、山东、宁夏等省区羊群均存在CEV感染现象,多为隐性感染,也有从患严重消化道和呼吸道症状病例中分离出该病毒的报道。目前国内CEV的研究资料较少,未见西南地区山羊CEV的研究报道。本研究旨在调查我国西南地区山羊群中CEV的分布及分子特征,取得了以下成果:1.检测CEV的RT-PCR方法的建立及西南三省区部分养殖场CEV的分子检测肠道病毒5′-UTR序列高度保守,是分子检测的主要靶点。本实验室前期研究发现我国CEV 5′-UTR已发生明显变异,已经影响现有RT-PCR方法对CEV的检出。本研究目的是建立针对流行毒株的通用性更好检测CEV的RT-PCR方法。根据CEV 5′-UTR的保守核苷酸序列,使用Primer 5.0设计1对引物,通过优化反应体系和条件,建立了检测CEV的RT-PCR方法,并与文献报道的6种5’-UTR检测方法进行比较。结果显示,该方法只特异性扩增CEV,不扩增其他9种腹泻相关的病原,阳性标准品作为模板进行组内和组间重复试验,显示稳定性好,对阳性标准品的最低检测限为8.5×10~2 copies/μL;本研究建立方法与其他6种RT-PCR对25份山羊腹泻样本中CEV的检出率分别为52%、40%、28%、20%、12%、12%、0,本方法所有检出样本与其他方法检出阳性样本相比,阳性样本符合率为100%。本研究多检出的阳性样本测序结果均证实为CEV。综上可见,本研究建立的RT-PCR检测方法特异性和稳定性好,提高了样本中CEV的检出率,为CEV检测和流行病学调查提供了更为可靠的手段。为了解CEV在四川、重庆、云南省区的流行情况,用本研究建立的方法对2019年9月-2021年5月采集自四川、重庆、云南三省区17个山羊养殖场269份粪便样本（包括腹泻样本153份和健康样本116份）进行了检测。结果显示,三省采集的粪便样本中CEV总阳性率为36.4%（98/269）（其中腹泻样本检出率为35.3%,健康样本检出率为37.9%）,场总阳性率88.2%（15/17）,其中重庆、四川、云南三省区阳性率分别为60.6%（43/71）、32.5%（54/166）、3.1%（1/32）。三省区的重庆、四川、云南场阳性率分别为100%（6/6）、88.9%（8/9）、50%（1/2）。结果表明CEV已在四川、云南、重庆省区山羊群中存在,且重庆、四川部分养殖场CEV感染较严重。本研究首次证实CEV已在西南部分地区山羊群中存在,丰富了西南地区病原谱,增加了国内CEV分布及流行相关资料,为CEV疾病防控提供参考。其中CEV健康粪便样本阳性率比腹泻样本中的阳性率更高存在的意义值得进一步研究。2.成功获得了3条CEV近似完整基因组并进行研究为了解西南地区CEV的基因组特征,根据研究之初Gen Bank中仅有的3条完整的CEV基因组序列设计14对引物,分段扩增20份阳性样本中CEV基因组序列,使用Seqman软件组装病毒基因组,分析其基因组特征。结果仅从1个场的3个样本中扩增出的目的片段拼接获得3条基因组序列（5′-UTR N端有69 bp-115 bp未获得）,命名为SWUNF3、SWUNF7、SWUNF10,其基因组序列均含一个大的ORF、两端的非编码区（5′-UTR和3′-UTR）以及poly（A）尾,是典型的肠道病毒基因组结构。获得的基因组长7308 bp-7341 bp,G+C含量为48.25%-48.63%,ORF的长度为6519 bp/2172 aa-6521 bp/2173 aa,其他17个阳性样本获得数量不等的目的片段,无法拼接成基因组序列未进行分析。经分型标准确定3个基因组与TBE-OEV同属于G5型肠道病毒,表明G5型CEV已在四川山羊养殖场中独特存在。与Gen Bank中的12条完整VP1基因相比,以TB4-OEV为参考株,获得的3条基因组序列的VP1的核苷酸有义突变较多,部分氨基酸变异出现频率较高,F7和F10 VP1有14个独特的aa变异（T10N、H11T、Q18R、S132D、V138T、V153I、D205N、L210T、S218N、S221T、E235Q、E269Q、Y273F）;F3 VP1插入一个谷氨酰胺Q（3-Q-4）,具有22个独特变异（V7T、S10N、H11T、E13N、G14Q、L16V、N17D、A29T、T90S、S93T、V96T、N98A、S132D、A138T、T153I、Q210T、A218N、S221T、V231A、A235Q、I273F、N279E）。其中三条VP1具有相同的氨基酸变化位点有3个（H11T、S132D、S221T）,鉴于VP1在病毒感染过程中参与受体识别、诱导中和抗体的产生,这些VP1的突变和插入是否会影响病毒的功能和致病性还有待后续研究证实。这是首次在国内获得G5型肠道病毒基因组,丰富了CEV的基因组信息,分析发现3条基因组的VP1核苷酸的序列突变引起氨基酸的突变,具有多个独特位点aa的变化,这些突变的生物学意义有待进一步研究。