论文部分内容阅读
目的原核表达和鉴定刚地弓形虫致密颗粒蛋白5(GRA5),以期获得大量与天然抗原活性相似的弓形虫重组GRA5蛋白抗原,将获得的重组蛋白进行纯化,应用纯化的GRA5重组蛋白抗原包被在96孔板上,建立ELISA法检测弓形虫感染。方法从GenBank中查到弓形虫GRA5基因序列,根据基因序列设计合成一对引物,用RT-PCR方法将GRA5基因扩增,构建pET28a-GRA5原核表达载体,双核酸内酶切及序列测定进行鉴定,IPTG诱导pET28a-GRA5转化的BL21/DE3菌,SDS-PAGE和Western-blotting分析表达产物并鉴定弓形虫GRA5是否表达。建立以纯化的重组蛋白的间接ELISA法,检测收集样本血清中弓形虫特异性抗体。结果成功构建刚地弓形虫GRA5基因原核表达质粒,PCR反应扩增出为363 bp大小的GRA5基因,所构建的pET28a-GRA5原核表达载体经双酶切显示插入片段大小与上相符,DNA测序结果表明与GenBank中录入的GRA5基因经Blast比对序列同源性100%,原核细胞表达的该重组蛋白在SDS-PAGE和Western blot中均有显示(约14 ku)。将重组GRA5蛋白作为抗原包被在96孔板中,建立了检测弓形虫感染的ELISA方法,ELISA法经过优化后最终确定:最佳抗原包被浓度为10ug/ml、最佳条件为在37℃作用2h后,在4℃包被过夜、弓形虫血清最佳稀释度为1:25,最佳封闭条件为用5%脱脂奶粉在37℃作用2h,二抗最佳工作浓度为1:20000,底物的最佳反应时间为20min。本实验建立的ELISA法检测的100例弓形虫感染病人(血清学阳性)血清中有73例呈阳性,阳性率为73%(73/100),其中40例IgG阳性标本的阳性率为72.5%(29/40),30例IgM阳性标本的阳性率为53.3%(16/30),30例IgG、IgM均阳性标本的阳性率为93.3%(28/30),30例阴性血清标本的阳性率仅为6.7%(2/30)