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急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)是由多种因为引起胰酶在胰腺内被激活而导致的以胰腺局部炎症反应为主、伴或不伴其它器官功能改变的疾病。AP通常有自限性,但约20％的病例会发展为重症急性胰腺炎(severe AP,SAP),出现胰腺坏死和多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)。SAP死亡率在30％～50％,而且自上世纪70年代以来并没有明显降低。由于死亡率高,病理生理机制不清,缺乏切实有效的特异性疗法,SAP仍然是临床上的一大难题。
尽管SAP的确切机制尚未完全阐明,但大量促炎因子分泌入血和随后形成的全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)被认为是SAP致死的主要因为。其中,肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)是首要的促炎因子,在SIRS中居于核心地位,对SAP多器官损伤和病人死亡起着关键作用。很多证据表明,抗TNF-α治疗在实验性胰腺炎中具有保护作用。
重组纤溶酶Ⅱ(recombinant fibrinogenaseⅡ,rFⅡ)是本实验室从五步蛇(学名:尖吻蝮蛇,Agkistrodon Acutus)毒腺表达型cDNA文库中表达纯化的基因重组溶栓药。它在体外能降解纤维蛋白和TNF-α,在败血症和弥散性血管内凝血(disseminated intravascular coagulation,DIC)动物模型上均有保护作用。基于TNF-α在SAP中的重要作用和rFⅡ降解TNF-α的前期实验,本论文用rFⅡ治疗SAP动物模型并在体外进一步确认rFⅡ对TNF-α的作用。
方法：
用经胆胰管逆行灌注5％牛磺胆酸钠的方法,在雄性SD大鼠上建立SAP模型。大鼠随机分成四组:对照(control,Con)组:胆胰管灌注生理盐水,静脉注射生理盐水；模型(SAP)组:胆胰管灌注5％牛磺胆酸钠,静脉注射生理盐水；rFⅡ治疗(rFⅡ)组:胆胰管灌注5％牛磺胆酸钠,静脉注射rFⅡ(1mg/kgBW)；Infliximab治疗(Inf)组:胆胰管灌注5％牛磺胆酸钠,静脉注射Infliximab(8mg/kg BW)。给药起始时间为病程的0.5h,总时程约3h。
观察各组大鼠24h内的存活情况。
取0、3、6、9、12h的大鼠血清样品,用碘-淀粉比色法测定血清淀粉酶活性,用ELISA法检测TNF-α、白细胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-6和IL-10的浓度。
取12h的大鼠胰腺和右肺,测定湿干重比,进行病理切片和病理学评分。取6h的大鼠腹水,测定腹水指数和腹水TNF-α浓度；分离、培养、鉴定大鼠腹腔巨噬细胞；用四甲基偶氮唑蓝(3-(4,5-dimethylthiazol-2-y1)2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT)法测定各组大鼠腹腔渗出巨噬细胞(peritoneal exudatemacrophages,PEMs)的相对数量；测定各组大鼠PEMs培养12h后分泌的TNF-α和IL-1β浓度。
在胰腺炎相关PEMs模型中,用1ng/ml rFⅡ作用不同时间和用不同浓度的rFⅡ作用1h,观察rFⅡ对TNF-α和IL-1β分泌的影响。
在胰腺炎相关腹水(pancreatitis-associated ascitic fluid,PAAF)诱导的固有腹腔巨噬细胞(resident peritoneal macrophages,RPMs)模型中,用1μg/ml rFⅡ作用3h,观察rFⅡ对TNF-α和IL-1β分泌的影响。
在体外,将0.1μg rFⅡ分别与2.5μg人TNF-α、小鼠TNF-α和大鼠TNF—α在37℃孵育2h,用SDS-PAGE分析产物的情况。
在体外,用不同浓度的rFⅡ与初始浓度为1000pg/ml的大鼠TNF-α和人TNF-α在37℃孵育1h,用ELISA法检测剩余TNF-α浓度,并绘制量效曲线,计算rFⅡ对两种TNF-α的半数抑制浓度(inhibition concentration at50％effect,IC50)。
结果：
rFⅡ治疗能够显著提高SAP大鼠的生存率(P=0.006),减轻胰腺和肺的损伤,抑制腹腔炎症,降低血清TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10的浓度。这些效果与Infliximab相似。
在胰腺炎相关PEMs中,rFⅡ对TNF-α分泌的抑制作用具有时间和浓度依赖性。在PAAF诱导的RPMs模型中,rFⅡ也能抑制TNF-α的分泌。rFⅡ在两种细胞模型中均对IL-1β的分泌没有影响。
在37℃孵育2h,0.1μg rFⅡ能将2.5μg人TNF-α和小鼠TNF—α完全降解,但不能完全降解2.5μg大鼠TNF-α。在37℃孵育1h,rFⅡ对1000pg/ml大鼠TNF—α的IC50为269.0(244.7～295.8)pg/ml,对1000pg/ml人TNF-α的IC50为30.74(28.38～33.29)pg/ml。
结论：
rFⅡ通过真接可能降解TNF-α,对牛磺胆酸钠诱导的大鼠SAP模型具有治疗作用；rFⅡ对人TNF—α的降解效价大约是它对大鼠TNF-α的降解效价9倍。这些结果提示重组蛇毒金属蛋白酶在治疗SAP上可能具有临床应用前景。