【摘 要】
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该研究构建了适宜的基因打靶载体,通过体细胞基因打靶来获得敲除α1,3GT基因的细胞系,并在此基础上展开相应的细胞方面的研究工作,为异种器官移植的深入研究打下良好基础.首
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该研究构建了适宜的基因打靶载体,通过体细胞基因打靶来获得敲除α1,3GT基因的细胞系,并在此基础上展开相应的细胞方面的研究工作,为异种器官移植的深入研究打下良好基础.首先,对α1,3GT基因进行测序并与已知的cDNA及部分基因组序列进行比较,进一步分析酶切图谱,选择两段适宜的序列作为打靶载体的5和3同源臂.采用优化的高压电击法将pINGT转染胎儿成纤维细胞(10<7>个),经7天的G418(600μg/ml)药物筛选,共获得541个细胞克隆.其中有106个克隆是发生非同源重组的荧光细胞克隆.目前已分离培养150个阳性克隆,对其中11个克隆(包括1个绿色细胞克隆)进行了PCR鉴定,结果表明,均为整合阳性.转染pLPC-hTERE基因的胎儿成纤维细胞,经嘌呤霉素药物筛选后的得到稳定的转hTERE基因的阳性细胞.传代培养至第17代与对照细胞相比,在细胞的生长状况及繁殖能力方面均无明显差异,初步说明人端粒酶基因的表达不影响猪成纤维细胞的正常生长.
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