沙门菌不仅给畜禽养殖业造成巨大的经济损失,也对人类的公共健康造成严重威胁。本研究从表型到基因型水平上对2012～2017年在江苏省分离的沙门菌菌株进行耐药性系统研究,确定主要的流行克隆及传播规律。采用全基因组测序技术并基于生物信息分析,对近年来流行的印第安纳沙门菌（S.Indiana）的分子特征（耐药基因、毒力因子、金属抗性基因及可移动遗传元件等）进行比较分析,同时分析1类整合子与S.Indiana多重耐药之间的关系,进一步阐明S.Indiana多重耐药形成机制。另外,通过体内和体外试验系统评价了S.Indiana流行菌株的致病性。1.不同来源沙门菌的分型和耐药性分析本研究对江苏省2012～2017年沙门菌流行病学调查中从动物（猪、鸡）和人群（健康人群及食源性疾病患者）中分离到的254株沙门菌进行血清型分型、耐药基因鉴定、多位点序列分型（MLST）、聚类分析以及1类整合子的检测等,研究沙门菌在动物与人之间的流行状况,发现主要分子流行克隆及传播规律。对254株沙门菌血清型分型后发现,主要分为9个血清型,其中肠炎沙门菌（S.Enteritidis）分离率（37.01%,94/254）最高,其次是S.Indiana（18.90%,48/254）和德尔卑沙门菌（S.Derby）（14.17%,36/254）。动物源沙门菌分离株中以S.Enteritidis（38.38%,71/185）和 S.Indiana（25.41%,47/185）最多,其中鸡源沙门菌以 S.Enteritidis（53.79%,71/132）和S.Indiana（34.09%,45/132）为主;猪源中则以S.Derby（52.83%,28/53）为主。人源沙门菌以S.Enteritidis（33.33%,23/69）和鼠伤寒沙门菌（S.Typhimurium,27.54%,19/69）为主,仅有1株S.Indiana分离自食源性疾病患者。利用MLST分型方法,254株沙门菌可以分为19个ST型,ST11、ST17、ST40与ST19占比最高,其中S.Indiana均属于ST17。对254株沙门菌ST型聚类分析及邻接法（Neighbor-Joining,NJ）构建进化树,结果表明其主要分为5个主要克隆复合体（clonal complexes,CCs）,即CC11、CC17、CC19、CC40和CC68。药敏实验结果表明,耐药性最为严重的血清型为 S.Indiana,其次为 S.Enteritidis,多数 S.Indiana 菌株为多重耐药（Multi-drug resistance,MDR）。利用PCR方法进一步检测耐药基因,结果表明多数耐药基因均可以在S.Indiana中检测到,尤其以氨基糖苷类耐药基因检出率最高,依次为氯霉素类、β-内酰胺类和甲氧苄胺类耐药基因。多数S.Indiana携带如下耐药基因簇:blaCTX-M（and/or blaOXA-1-like+blaTEM-1-like）,sul1,aacC4,aac（6’）-Ib,floR 和 dfrA17。1类整合子的检测结果表明,22.83%（58/254）的沙门菌菌株为阳性,尤其以S.Indiana中1类整合子的阳性率最高,为64.58%（31/48）,其次为汤卜逊沙门菌（S.Thompson）,为44.44%（4/9）。以上结果表明,S.Indiana已经成为鸡源沙门菌中分离率第二高的菌株,绝大多数具有多重耐药（Multi-drug resistance,MDR）性,且多数菌株携带1类整合子及大量的耐药基因。2.印第安纳沙门菌多重耐药形成机制本研究选取了 6株S.Indiana菌株,通过高通量测序获得完整核苷酸序列,分析其耐药基因、金属抗性基因、毒力因子和可移动遗传元件（MGEs）等,并对其染色体和质粒进行共线性及进化分析,探究并验证其多重耐药的机制。结果表明,多数S.Indiana携带11～22个耐药基因,其大质粒中携带大量的可移动遗传元件（Mobile Genetic Elements,MGEs）和耐药基因。S.Indiana 222菌株中大质粒大小为308.6kb,携带8类19种共22个耐药基因,是目前发现携带耐药基因最多的质粒。多数S.Indiana携带10种左右不同的转座子,有些菌株甚至还携带大量编码转座酶的插入序列（Insertionsequence,IS）。多数沙门菌携带8～10碲抗性基因,除此之外,S.Indiana分离株还携带汞、铜、银抗性基因,并且这些金属抗性基因多分布于质粒整合子两侧,推测这很有可能与S.Indiana获得大量耐药基因具有多重耐药表型相关。6株S.Indiana核苷酸序列共线性分析结果表明质粒的共线性较弱,存在大量的基因重排、倒位及基因片段的缺失现象,这表明6株S.Indiana的质粒均经历过频繁的重组以获得大量耐药基因。在高通量测序结果首次发现S.Indiana中还存在一种只有699 bp的整合酶,与intI1具有67.06%的核苷酸同源性,将其命名为intI1-15。通过体外整合系统比较两种整合酶整合功能,结果发现intI1-15整合酶具有整合耐药基因的功能,但其整合频率显著低于intI1整合酶的整合频率,但对于S.Indiana来说携带两种类型的整合酶拓宽了其抗性基因获得的途径,有利于其多重耐药性的形成。S.Indiana和非S.Indiana的耐药基因与1类整合子的相关性分析表明,S.Indiana中的耐药基因与1类整合子呈极强相关性,而其他血清型则为弱相关。同时质粒接合转移实验表明携带整合子的受体菌株的接合转移频率显著高于无整合子的受体菌株。综上表明,S.Indiana携带大量的耐药基因,在S.Indiana中存在迄今为止携带耐药基因最多的质粒,同时S.Indiana中存在两种整合酶,推测这是其多重耐药形成的主要原因。3.印第安纳沙门菌致病性的系统性评价S.Indiana携带大量耐药基因,存在扩散到人类的潜在风险。本研究通过其他血清型沙门菌与新流行S.Indiana菌株比较,利用体内和体外试验,系统性地研究S.Indiana的致病性。我们观察了口服不同血清型沙门菌（S.Indiana、S.Thompson、S.Enteritidis和S.Typhimurium）小鼠的临床症状和组织病理学变化,并进行了小鼠急性口服毒性试验,使用改良寇氏法确定了沙门菌对小鼠的半数致死量（LD50）。结果表明,四种血清型的沙门菌均可引起小鼠不同程度的临床症状和组织病理学变化,其病变包括肝脏表面不同程度的白色坏死灶,肠道鼓气充盈及其内容物呈淡黄色粘液状。在肝脏病理切片中观察到单核/巨噬细胞浸润、凝血坏死和出血等组织病理学变化;肠绒毛均变短脱落,粘膜下层可见淋巴细胞浸润。其粘膜上皮细胞呈现变性、坏死和脱落,肠绒毛缩短且不完整。其中S.Indiana造成的病变较轻,S.Typhimurium和S.Enteritidis最为严重。大部分S.Indiana菌株对小鼠的半数致死量约为105 CFU/mL,是S.Enteritidis与S.Typhimurium对小鼠半数致死量的数倍甚至数十倍。在模拟胃肠液的连续培养后,通过激光共聚焦显微镜观察并测定沙门菌对小鼠肠上皮原代细胞（IECs）的粘附作用,采用CFU计数法测定沙门菌对小鼠肠上皮原代细胞（IECs）、小鼠单核巨噬细胞白血病细胞系（RAW264.7）细胞和人结直肠腺癌细胞系（Caco-2）细胞的粘附和侵袭性以及胞内增殖能力。结果表明多数S.Indiana粘附、侵袭细胞的细菌数量显著低于其他血清型,且在细胞内的增殖趋势与粘附于细胞表面和侵入细胞内部的细菌数量呈正相关。然而个别菌株,比如S.Indiana 222分离株粘附于IECs细胞及Caco-2细胞表面和侵入细胞内部的细菌数量在11株沙门菌分离株中都是最少的,但其在细胞内增殖速率却最快,这值得我们进行更深入的研究。总之,与其他血清型的沙门菌相比,S.Indiana对小鼠具有致病性,能够引起肝脏和肠道的病理变化,但其致病性低于其他血清型沙门菌。综上,S.Indiana分离率仅次于S.Enteritidis,鸡是其主要来源,但在人群中也偶有分离到。S.Indiana是一种对多数抗菌药具有抗性的多重耐药（MDR）菌株。S.Indiana中存在目前携带耐药基因最多的质粒,且S.Indiana携带一种新发现的整合酶,加速其多重耐药性的形成。S.Indiana对小鼠具有致病性,虽然其致病力低于其他血清型沙门菌,但由于其具有传播到人的风险,因此需加强对S.Indiana的监测及防控。