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目的高良姜素是一种从高良姜块茎中提取分离得到的天然黄酮类化合物,具有广泛的抗肿瘤活性,然而其是否具有抗胆管癌活性,目前还未见报道。本研究将探索高良姜素对人肝内胆管癌细胞株HCCC9810和肝外胆管癌细胞株TFK-1增殖、迁移、侵袭、凋亡等功能的影响及其分子机制。方法以HCCC9810和TFK-1为研究模型,通过CCK-8实验得出不同浓度高良姜素处理的HCCC9810和TFK-1的活性,分别拟合出两株细胞的IC50值,确定后续实验的给药浓度;通过Ed U实验检测高良姜素对HCCC9810增殖能力的影响;通过流式细胞术检测高良姜素对HCCC9810和TFK-1凋亡的影响;通过Transwell迁移侵袭实验和划痕实验分析高良姜素对HCCC9810和TFK-1迁移和侵袭能力的影响;通过q RT-PCR实验分析高良姜素对人胆管癌细胞HCCC9810中mi R-21-5p水平的影响;采用蛋白免疫印迹（Western blot）实验探索高良姜素对HCCC9810和TFK-1中Bcl2、Bax、MMP9、Vimentin、PTEN、AKT、P-AKT蛋白表达水平的影响;使用mi R-21-5p agomir在HCCC9810中过表达mi R-21-5p,然后再使用高良姜素处理,通过Ed U实验、流式细胞术、Transwell迁移侵袭实验、划痕实验、q RT-PCR、蛋白免疫印迹实验检测相关指标考查mi R-21-5p是否介导了高良姜素的抗胆管癌活性。结果A.（1）高良姜素显著抑制HCCC9810和TFK-1的活性（P<0.05）,计算得出IC50分别为108.2umol/L和149.7umol/L,综合考虑,取150umol/L作为后续实验浓度。（2）Ed U实验结果表明,经高良姜素处理24h的HCCC9810 Ed U平均阳性率较对照组显著降低（P<0.05）,提示高良姜素可显著抑制胆管癌细胞增殖。（3）流式细胞术结果表明,经高良姜素处理24h的HCCC9810和TFK-1平均早期凋亡率显著大于对照组（P<0.05）;WB结果显示,经高良姜素处理24h的HCCC9810和TFK-1中Bax/Bcl2显著大于对照组（P<0.05）,提示高良姜素可显著诱导胆管癌细胞凋亡。（4）Transwell迁移实验结果表明,经高良姜素处理24h的HCCC9810和TFK-1中穿过聚碳酸酯膜的平均细胞数显著小于对照组（P<0.05）;Transwell侵袭实验结果则表明,经高良姜素处理24h的HCCC9810和TFK-1中穿过聚碳酸酯膜的平均细胞数显著小于对照组（P<0.05）;WB结果显示,经高良姜素处理24h的HCCC9810和TFK-1中MMP9蛋白表达水平显著小于对照组（P<0.05）,经高良姜素处理24h的HCCC9810和TFK-1中Vimentin蛋白表达水平显著小于对照组（P<0.05）,提示高良姜可抑制胆管癌细胞迁移和侵袭。B.（1）使用100nmol/L的mi R-21-5p antagomir和antagomir NC转染HCCC9810 24h后进行Ed U试验,结果表明mi R-21-5p antagomir组平均Ed U细胞阳性率较对照组显著降低,提示敲低mi R-21-5p显著抑制胆管癌细胞增殖（P<0.05）,因此我们接下来使用100nmol/L的mi R-21-5p agomir转染HCCC9810 24h过表达mi R-21-5p,后应用高良姜素处理24h,进一步探索高良姜素抗胆管癌的分子机制。（2）收集RNA进行q RT-PCR实验,结果表明,高良姜素处理组mi R-21-5p表达量较对照组显著下降（P<0.05）;而mi R-21-5p agomir+高良姜素组中mi R-21-5p表达量较agomir NC+高良姜素组显著升高（P<0.05）,提示mi R-21-5p agomir过表达mi R-21-5p成功。（3）Ed U实验结果显示,mi R-21-5p agomir+高良姜素组平均Ed U阳性细胞率显著高于agomir NC+高良姜素组平均Ed U阳性细胞率（P<0.05）,提示过表达mi R-21-5p可部分取消高良姜素的抗胆管癌增殖作用。（4）流式细胞术结果显示,HCCC9810和TFK-1的mi R-21-5p agomir+高良姜素组平均早期凋亡率显著低于对照组（P<0.05）;而WB结果则显示,HCCC9810和TFK-1的mi R-21-5p agomir+高良姜素组平均Bax/Bcl2显著低于对照组（P<0.05）,提示过表达mi R-21-5p可部分逆转高良姜素的促胆管癌凋亡作用。（5）Transwell迁移实验结果显示,HCCC9810和TFK-1 mi R-21-5p agomir+高良姜素组穿过聚碳酸酯膜的平均细胞数显著高于对照组（P<0.05）;Transwell侵袭实验结果则显示,HCCC9810和TFK-1 mi R-21-5p agomir+高良姜素组穿过聚碳酸酯膜的平均细胞数显著高于对照组（P<0.05）;划痕实验则表明,HCCC9810 mi R-21-5p agomir+高良姜素组的平均迁移距离显著高于对照组（P<0.05）;而WB结果显示,HCCC9810和TFK-1 mi R-21-5p agomir+高良姜素组的平均MMP9表达水平显著高于对照组（P<0.05）,其平均Vimentin表达水平显著高于对照组（P<0.05）,提示过表达mi R-21-5p可部分取消高良姜素的抗胆管癌迁移、侵袭功能。C.WB结果表明,高良姜素组PTEN蛋白平均表达水平显著高于对照组（P<0.05）;高良姜素组P-AKT蛋白平均表达水平显著低于对照组（P<0.05）;而mi R-21-5p agomir+高良姜素组PTEN蛋白平均表达水平为显著低于agomir NC+高良姜素组（P<0.05）;而mi R-21-5p agomir+高良姜素组P-AKT蛋白平均表达水平显著高于agomir NC+高良姜素组（P<0.05）,这些结果提示高良姜素可显著提升胆管癌细胞PTEN蛋白表达水平,显著降低P-AKT蛋白表达水平,而这些效果可被过表达mi R-21-5p部分取消。结论（1）高良姜素具有显著的抗胆管癌活性。（2）mi R-21-5p可能通过调节PTEN/AKT信号通路部分介导高良姜素的抗胆管癌活性。