【背景】肝细胞肝癌是世界上第六大常见的肿瘤,其致死率高居所有肿瘤的第三位。尽管肝癌的诊疗技术在不断的提高,但因肝癌发病因素复杂、易发生转移、对化疗不敏感和手术切除后易复发等原因,肝癌患者的整体生存率仍然不高。因此,深入肝癌发生发展的相关分子机制研究,寻找新型的潜在的肝癌治疗靶点具有重要的现实意义。着丝粒是染色单体上的蛋白结构体,在染色体分离的过程中起到重要的调控作用,其调节失调或功能紊乱会导致非整倍体的出现和促进肿瘤的发生。着丝粒至少由80种不同的着丝粒蛋白组成,包括着丝粒蛋白A、B、C、I、K和M等,在肿瘤发生发展中起到重要的作用。着丝粒蛋白K(Centromere protein K,CENPK)是着丝粒蛋白家族成员之一,在维持着丝粒的功能和有丝分裂过程中可以起到重要的作用。研究发现,CENPK在多种肿瘤中表达上调,并与肿瘤的恶性进展相关,可能扮演着致癌基因的角色。然而,CENPK在肝癌中表达情况及临床意义尚不明确,其具有的生物学功能和相关机制也有待进一步深入探索。因此,本研究的主要目的是探讨CENPK在肝癌中的表达及其相关的功能和机制。【实验目的】1.探讨CENPK在肝癌中的表达情况及临床意义;2.研究CENPK对肝癌细胞恶性生物学功能的影响;3.探讨CENPK调控肝癌细胞恶性改变的相关机制。【实验方法】1.首先在TCGA数据库统计分析CENPK在肝癌中的表达情况及临床意义,然后在临床收集的肝癌标本上利用荧光实时定量PCR和Western Blot方法检测CENPK的表达,对TCGA的结果进行进一步验证;2.构建CENPK干扰病毒载体,感染肝癌细胞系,建立稳定下调CENPK表达和对照组NC的肝癌细胞。通过Celigo细胞计数、CCK-8、平板克隆形成、划痕以及Transwell实验检测CENPK对肝癌细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响;通过裸鼠皮下成瘤实验,在体内检测CENPK对肝癌细胞增殖能力的影响;3.利用基因芯片技术筛选稳定下调CENPK表达组和对照组NC肝癌细胞BEL-7404之间差异的基因表达谱,通过IPA分析获得CENPK调控的关键通路分子,然后通过荧光实时定量PCR、Western Blot和细胞免疫荧光方法进行验证;利用YAP1干扰病毒下调肝癌细胞中YAP1的表达,观察下调YAP1的表达后肝癌细胞增殖、侵袭和迁移能力的改变。在CENPK稳定下调的肝癌细胞SMMC-7721中过表达YAP1后观察肝癌细胞的功能恢复情况。进一步通过Western Blot方法检测CENPK和YAP1对EMT标志物表达的影响。【实验结果】1.TCGA数据库中显示,CENPK在肝癌组织中表达升高,与临床分级、T分期、病理分期和患者预后相关;在本科室收集的肝癌组织和相对应的癌旁组织样本中证实CENPK的mRNA水平在肝癌组织中表达增高(86.7%,26/30),蛋白水平也在肝癌组织中表达增高(75%,6/8)。2.成功构建CENPK干扰慢病毒载体并感染肝癌细胞系BEL-7404和SMMC-7721,构建稳定下调CENPK的肝癌细胞;通过Celigo细胞计数、CCK-8、平板克隆形成和裸鼠皮下成瘤实验证实下调CENPK的表达后能够抑制肝癌细胞的增殖能力;通过划痕以及Transwell实验证实下调CENPK的表达后能够抑制肝癌细胞的侵袭迁移能力;3.基因芯片数据分析结果显示,CENPK主要与恶性实体瘤、肿瘤生长、肿瘤细胞增殖、干细胞增殖、肿瘤细胞侵袭、细胞侵袭和上皮组织的发育等疾病或功能相关,YAP1可能在CENPK参与调控肝癌恶性进展中起到重要的作用;荧光实时定量PCR、Western Blot和细胞免疫荧光方法证实下调CENPK的表达后肝癌细胞中YAP1的mRNA和蛋白的表达均降低;4.利用YAP1干扰病毒能够成功下调肝癌细胞中YAP1的表达,下调YAP1的表达能够抑制肝癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力,可以部分模拟下调CENPK对肝癌恶性进展的抑制作用,而过表达YAP1的表达后能够部分恢复下调CENPK所起到的抑制效应;5.Western Blot实验结果表明,下调CENPK和YAP1的表达后都能够上调上皮标志物E-cadherin的表达,而降低间质标志物N-cadherin的表达;在稳定下调CENPK表达的肝癌细胞SMMC-7721中过表达YAP1后,可以部分逆转下调CENPK所引起的EMT的抑制效应。【结论】1.CENPK在肝癌组织表达增高,与肝癌的恶性表型及预后相关;2.下调CENPK的表达能够在体内外水平抑制肝癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力;3.下调CENPK的表达能够抑制肝癌细胞的EMT过程,过表达YAP1后能部分恢复抑制EMT的作用;4.CENPK可以通过调控YAP1的表达影响肝癌的恶性进展。靶向作用于CENPK/YAP1可以为肝癌的治疗提供新的思路。