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实验目的:探索树突状细胞的自噬与哮喘发生发展的相关机制,并进一步研究BMMSCs对树突状细胞的自噬与功能的影响。实验方法:一、首先明确哮喘模型肺源DCs自噬水平的高低;将BALB/c小鼠分为急性哮喘组和空白对照组:哮喘组利用卵清蛋白(OVA)诱导建立小鼠过敏性哮喘模型。H-E染色观察各组小鼠肺组织的病理改变,酶联免疫吸附实验、蛋白质印迹实验分别检测各组小鼠血清OVA特异性Ig E、BALF的IL4/13因子的表达水平、肺DCs自噬水平。二、深入探索调节树突状细胞的自噬对哮喘的影响:1、将BALB/c小鼠分为3组:急性哮喘组(哮喘组)、哮喘自噬抑制剂CQ治疗组(CQ组)和空白对照组(对照组),其中哮喘组和CQ组利用卵清蛋白(OVA)诱导建立小鼠过敏性哮喘模型,CQ组加用自噬抑制剂氯喹(CQ)进行激发前干预。H-E染色观察各组小鼠肺组织的病理改变,酶联免疫吸附实验、蛋白质印迹实验、流式细胞仪分别检测各组小鼠血清OVA特异性Ig E、肺DCs自噬水平及表面共刺激分子、MHCⅡ的表达水平。2、体外用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3MA)抑制C57/B6小鼠骨髓源DCs自噬,检测DCs表面共刺激分子、MHCⅡ的表达。3、获取OT2小鼠脾脏CD4+T淋巴细胞,与各组DCs以1:10的比例混匀,流式细胞仪检测T细胞的增殖情况与活化反应。三、进一步探讨BMMSCs对树突状细胞的自噬与功能的影响:1、BALB/c小鼠分为空白对照组、哮喘组、MSCs细胞治疗组(MSC组)3组,其中哮喘组和MSC组利用卵清蛋白(OVA)诱导建立小鼠过敏性哮喘模型,MSC组于激发前一天尾静脉注射MSCs细胞混悬液。H-E染色观察各组小鼠肺组织的病理改变,酶联免疫吸附实验分别检测各组小鼠血清OVA特异性Ig E、肺泡灌洗液的IL4/13因子的表达水平。2、骨髓来源的DCs分为对照组(CON组)、LPS预处理DCs组(LPS-DC组)及MSCs与DCs共培养组(MSC-DC组),再分别收取各组DCs后行流式细胞术检测DCs表面CD40、CD86、MHCⅡ表达水平体,蛋白质印迹实验检测各组DCs自噬水平。3、获取OT2小鼠脾脏CD4+T淋巴细胞,与各组DCs以1:10的比例混匀,流式细胞仪分析T细胞的增殖情况。实验结果:一、哮喘小鼠肺DCs自噬水平升高:1、哮喘组小鼠肺炎浸润明显,血清OVA特异性Ig E水平、BALF IL-4和IL-13因子水平高于对照组(P均<0.05);2、哮喘组肺DCs的LC3Ⅱ/Ⅰ及LC3Ⅱ/ACTIN比率均高于对照组,哮喘组肺DCs自噬水平比对照组升高明显。二、抑制树突状细胞的自噬改善哮喘病情:1、哮喘组小鼠血清OVA特异性Ig E水平高于对照组(P<0.05),而CQ组血清OVA特异性Ig E水平较哮喘组降低(P<0.05);2、HE染色:哮喘组小鼠血管周围及细支气管有大量炎性细胞浸润,部分肺泡的间隔有增宽及断裂,炎症浸润多于对照组;而与哮喘组相比,CQ组血管和支气管周围炎症细胞浸润明显减少;3、自噬的检测:哮喘组肺DCs的LC3Ⅱ/Ⅰ及LC3Ⅱ/ACTIN比率均高于对照组;而较于哮喘组,CQ组肺DCs的LC3Ⅱ/Ⅰ及LC3Ⅱ/ACTIN比率均降低,说明哮喘组肺DCs自噬比对照组高,而CQ组肺DCs的自噬较哮喘组下降;4、相比对照组,哮喘组肺DCs表面共刺激分子CD80、CD86及MHCⅡ均升高(P<0.05);CQ组与哮喘组相比CD86及MHCⅡ均降低(P<0.05),CD80也有下降趋势(P>0.05);5、与对照组相比,OVA组DCs表面共刺激分子CD40、CD86及MHCⅡ均升高(P<0.05),3MA组与OVA组相比CD86及MHCⅡ均降低(P<0.05),CD40也呈现下降趋势(P>0.05);6、相较于对照组,哮喘组肺DCs诱导的CD4+T细胞增殖增加(P<0.05),而CQ组与哮喘组相比肺DCs诱导的T细胞增殖降低(P<0.05),说明抑制DCs自噬能降低DCs诱导的OT2小鼠T细胞的增殖能力;7、哮喘组T细胞CD69的表达水平高于对照组(P<0.05),而CQ组T细胞CD69比哮喘组低(P<0.05),说明自噬抑制剂可以降低T细胞活化反应三、BMMSCs抑制DCs的自噬与功能,并改善哮喘:1、哮喘组小鼠血清OVA特异性Ig E水平高于对照组(P<0.05),而MSC组血清OVA特异性Ig E水平较哮喘组降低(P<0.05);2、HE染色:哮喘组小鼠肺有大量炎性细胞浸润,部分肺泡间隔有增宽及断裂,炎症浸润多于对照组;而与哮喘组相比,MSC组肺内炎性细胞浸润明显减少;3、哮喘组BALF中IL-4和IL-13因子的量比对照组要高(P<0.05),哮喘MSCs治疗组BALF中IL-4和IL-13因子比哮喘组下降(P<0.05);4、自噬的检测:LPS-DCs的LC3Ⅱ/Ⅰ及LC3Ⅱ/ACTIN比率均高于对照组(P<0.05);而较于LPS-DCs组,MSC-DCs的LC3Ⅱ/Ⅰ及LC3Ⅱ/ACTIN比率均降低(P<0.05),说明MSC-DCs的自噬较LPS-DCs组下降;5、MSC-DCs组与LPS-DCs相比,表面分子CD40及MHCⅡ均降低(P<0.05);6、LPS-DCs诱导的T细胞增殖增加,而MSC-DC组与LPS-DCs组相比诱导的T细胞增殖降低,说明MSCs能降低DCs诱导的OT2小鼠T细胞的增殖能力。实验结论:1、哮喘小鼠肺DCs自噬水平升高明显;2、自噬抑制剂可改善哮喘气道炎症,并抑制过敏性哮喘肺DCs的自噬,下调DCs表面共刺激分子及MHCⅡ的表达以及DCs诱导T细胞增值的能力;3、BMMSCs可抑制骨髓源DCs的自噬,下调DCs表面共刺激分子及MHCⅡ的表达以及DCs诱导T细胞增值的能力,并改善哮喘病情。