产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC)系一类致人和幼畜（初生羔羊、犊牛、羔羊及断奶仔猪）腹泻最常见的病原性大肠杆菌，其毒力因子主要包括黏附素菌毛、肠毒素、产志贺氏菌毒素、溶血素等。α-溶血素在ETEC的致病机理中很少受到关注，是一种RTX(repeats in toxin)毒素蛋白，对于大部分哺乳动物细胞（如红细胞、粒细胞、单核细胞和内皮细胞）都具有溶细胞活性和细胞毒性，能够整合进宿主细胞膜，影响细胞膜的稳定性，使其内容物渗漏或者裂解，是大肠杆菌肠外感染的一个重要的毒力因子。基于K88ac+/ K88ad+ETEC都具有溶血素基因，且两者病原致病机理不尽相同。我们成功构建hlyA毒素基因缺失株，为进一步深入研究hlyA毒素与机体相互作用的分子机制，溶血素的致病机理及对猪大肠杆菌病的防控策略奠定一定基础。　　1、利用Red同源重组技术构建hlyA基因缺失株　　根据GenBank中已报道的ETEC hlyA基因的序列，首先合成一对引物（引物5端与hlyA基因同源，而3端与pKD3质粒上氯霉素抗性基因cat同源），经PCR扩增后得到具有氯霉素抗性基因和hly基因同源臂的产物，将PCR扩增产物直接转化入大肠杆菌中，在pKD46表达的重组酶作用下，PCR产物两端的hlyA基因同源序列与大肠杆菌染色体上的的同源序列发生同源重组交换，利用抗性筛选得到阳性一次重组菌。利用编码Flp重组酶的质粒pCP20，去除氯霉素抗性基因，最后在染色体上只留下一个FRT位点，得到二次重组菌，通过PCR扩增及测序鉴定缺失株的正确构建。本试验成功构建了大肠杆菌标准株K88ac、K88ad的hlyA基因缺失株。同时我们将表达hlyA基因的pBR322质粒导入缺失株，构建了互补株。　　2、溶血素在大肠杆菌致病过程中作用初探　　在K88ac△hlyA、K88ad△hlyA成功构建的基础上，比较分析了野生株和缺失株相关生物学特性的变化。体外生长实验和酵解实验表明，同样的培养条件下，缺失株K88ac△hlyA、K88ad△hlyA株生长速度及生长周期各个阶段的特性与野生株相比基本没有差异，其分解发酵糖类和氨基酸的能力也未发生改变。同时将6周龄ICR小鼠分为1个对照组和6个攻毒组，经灌胃途径分别对各攻毒组小鼠接种109cfu剂量的大肠杆菌悬液，定期观察接种后小鼠的状态（饮食、饮水、精神状态和死亡情况），对死亡小鼠进行剖检记录病理变化，结果显示:经野生株和回补株攻毒的小鼠有出血死亡的现象，而缺失株没有，说明hlyA会影响大肠杆菌对ICR小鼠的致病性，增强大肠杆菌对ICR小鼠的毒力。在小鼠的十二指肠、空肠、回肠分离细菌，分别进行平板计数和PCR检测，结果表明:大肠杆菌在回肠的粘附能力比在十二指肠和空肠要强，且野生株和回补株比缺失株要强。