核定位信号肽(Nuclear localization signal,NLS)是一段由带正电荷的碱性氨基酸及其旁侧的调控元件组成的短肽,它能介导蛋白或核酸进入细胞核。目前研究发现,在生物体内各种功能性分子中,核定位信号肽广泛存在。蛋白分子通过核定位信号肽与转运蛋白结合,穿过核孔复合体(Nuclear pore complexes,NPC)进入出细胞核,从而完成自身结构的修饰、折叠包装或与特定靶分子结合,进而实现特定生物学信息的传递。PCV2 Cap蛋白是构成PCV2核衣壳结构的主要蛋白分子。根据研究报道,Cap蛋白N端1~41位氨基酸为富含精氨酸的NLS,能够介导蛋白进入细胞核,但是目前Cap蛋白进入细胞核后是否出核以及出核的调控机制未知。基于以上问题,我们针对PCV2 Cap蛋白进行了如下研究:1.猪圆环病毒2d亚型病毒样颗粒的制备与鉴定。从临床病料中扩增获得PCV2 Cap基因,并进行序列比对和抗原性分析,发现扩增获得的PCV2 Cap基因属于PCV2d亚型,在抗原性方面与国内PCV2a、PCV2b代表性毒株、以及疫苗株之间存在4个差异部位;利用杆状病毒表达系统将Cap基因进行表达,将目的蛋白进行Western blot、IFA、质谱以及透射电镜检测。结果表明,PCV2d Cap蛋白在昆虫细胞内成功表达并具有良好的免疫原性;PCV2d Cap蛋白在昆虫细胞内完成自组装,形成与天然病毒结构相似的病毒样颗粒(Virus-like particle,VLP),为PCV2d亚单位疫苗研制及诊断抗原开发提供了前期研究基础。2.制备了一株能够特异性识别PCV2病毒样颗粒的单克隆抗体。利用昆虫细胞表达系统分别制备了两种形式的Cap蛋白:PCV2 VLP和去掉NLS的Cap蛋白(tCap),以前者作为免疫原制备杂交瘤细胞,后者进行阳性克隆的筛选,获得一株能够分泌特异性识别tCap的杂交瘤细胞株(1F6),通过Western blot、IFA和免疫电镜对其生物学特性进行鉴定。结果显示,1F6能够特异性识别PCV2 VLP、天然PCV2和线性结构的Cap蛋白,为下一步研究Cap蛋白的出核及调控机制提供了基础。3.NLS通过磷酸化修饰调控PCV2 Cap蛋白出核。通过流式拍照技术对Cap及其突变体的胞内动态分布进行分析,发现NLS介导Cap蛋白进入细胞核后,然后介导Cap蛋白出核,NLS是PCV2Cap蛋白出核所必需和充分的组件;通过质谱技术对Cap蛋白的翻译后修饰进行分析,发现Cap蛋白NLS存在一个磷酸化修饰位点(S17),进一步通过流式拍照技术和激光共聚焦技术对该位点与Cap蛋白胞内转运的关系进行分析,发现NLS通过S17位点的磷酸化修饰启动PCV2 Cap蛋白的出核转运;另外,通过激光共聚焦技术对Rep(Rep’)蛋白和Cap蛋白的胞内转运关系进行分析,发现Cap蛋白的胞内转运不受Rep(Rep’)蛋白的影响。综上所述,本研究制备并鉴定了PCV2d亚型病毒样颗粒及针对该病毒样颗粒的单克隆抗体,证明了NLS是介导PCV2 Cap蛋白出核所必需和充分的组件,NLS通过磷酸化修饰调控Cap蛋白出核,为进一步理解PCV2病毒的复制机制提供了基础和理论依据。