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聚球藻PCC7002是一种单细胞海洋蓝藻,其全基因组序列已经公布,具有天然的DNA转化系统,被广泛地用做分子遗传学实验材料,是主要的转基因微藻的宿主之一。本研究中以野生型聚球藻PCC7002为材料,构建了转基因株,用于合成蜡酯,并以本实验室之前构建的产蜡丝状蓝藻wax-far1 EF113为对照,对产蜡条件进行了优化。研究的主要内容和结果如下:
1.构建的表达质粒将来源于不动杆菌的蜡酯合成酶基因(atfA)和小鼠的脂酰辅酶A还原酶基因的编码序列(FAR1 cDNA)置于蓝藻启动子PrbcL的控制之下。该质粒通过转化导入了野生型聚球藻PCC7002(简称WT7002)中,筛选转化子得到了能够合成蜡酯的藻株(简称wax-far17002),并确定了wax-far17002的最适培养基。
2.以wax-far17002和wax-far1 EF113为研究材料,发现随着培养时间的延长,转基因藻株中蜡酯的含量也不断增加,且摇床培养更有利于蜡酯的积累。对于wax-far1 EF113,培养基中氮的缺乏能显著促进藻细胞中蜡酯的合成,缺乏磷酸盐对于蜡酯的合成也有一定的促进作用；而对于wax-far17002,氮的缺乏对于蜡酯的积累没有明显的影响,但磷的缺乏对蜡酯的合成有一定的促进作用。
3.为了进一步提高转基因聚球藻PCC7002的蜡酯产量,在wax-far17002中对糖原代谢的相关基因ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(agp)和厌氧发酵相关的乳酸脱氢酶(ldhA)分别进行了敲除,得到的突变株命名 wax-farl-agp7002和wax-far1-ldhA-7002,对其总油脂的薄层层析分析表明:敲除agp和ldhA对于蜡酯的合成都有显著的促进作用。