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研究背景抑郁症（major depressive disorder,MDD）是以显著而持久的情绪低落、快感缺失为主要表现的人类最常见的精神疾病之一。MDD全球现患者约3.5亿。世界卫生组织指出,到2030年MDD将成为全球疾病负担的首位。然而,对MDD的病理生理机制仍然知之甚少。几十年来,MDD的治疗主要基于单胺假说,该假说认为中枢单胺类神经递质水平的耗竭是MDD发生的根本原因。然而基于单胺假说的常用抗抑郁剂对约30%的MDD患者无效。此外,即使这些抗抑郁剂在数小时内改变了突触间隙单胺的水平,其仍需要2-4周的时间才开始发挥临床功效。因此,迫切需要更好地了解MDD的细胞和分子机制。近年来“神经营养因子假说”受到广泛关注,脑源性神经营养因子（brainderived neurotrophic factor,BDNF）是最重要的神经营养因子之一且被广泛研究。该假说认为,神经营养信号的减少是MDD病理机制的主要因素,使其恢复是抗抑郁治疗起作用的潜在基础。BDNF在神经元存活、神经发生和突触可塑性中起重要作用。BDNF源自糖基化前体,前体神经营养因子（precursor BDNF,pro BDNF）,该蛋白被水解切割以产生成熟BDNF（mature BDNF,m BDNF）。组织型纤溶酶原激活物（tissue plasminogen activator,tPA）/纤溶酶系统是参与pro BDNF裂解的最重要的蛋白酶。m BDNF主要与酪氨酸激酶受体B（tyrosine kinase receptor B,TrkB）结合,具有抗凋亡并促进长时程增强的作用。与BDNF结合后,TrkB细胞内结构域的酪氨酸残基发生自磷酸化并触发下游通路的激活,最终导致包括转录因子c AMP反应元件结合蛋白（c AMP responseelement binding protein,CREB）在内的磷酸化和激活,介导神经元生存和分化不可或缺的相关基因的转录等细胞功能。其中神经肽VGF（非缩写）是可被BDNF大量诱导的神经肽前体,也是一种重要的神经营养因子。BDNF可能通过诱导CREB结合到VGF启动子区的CREB结合位点激活其表达。研究表明VGF参与介导海马突触可塑性、调节代谢和能量平衡,也可能参与抑郁的发病机制和介导抗抑郁反应。然而pro BDNF则优先与p75神经营养因子受体（p75neurotrophin receptor,p75NTR）结合,与m BDNF具有相反的作用,利于神经元凋亡和长时程抑制。因此,tPA/纤溶酶系统对pro BDNF的蛋白水解过程可能代表了一种调节BDNF方向的有力方式,而这又可能与MDD发病机制以及抗抑郁剂的作用机制有关。p11（也称为S100A10）是tPA活性启动的重要调节因子,且与MDD的病因和抗抑郁剂的作用机制密切相关。p11/tPA通路可能是调控BDNF平衡走向,参与MDD发病和抗抑郁剂起效的重要通路。目前对p11-tPA-BDNF通路在抑郁中的作用知之甚少。第一部分p11-tPA-BDNF通路因子水平与抑郁症及抗抑郁剂治疗的相关性一、血清tPA-BDNF通路因子蛋白水平在抑郁症和抗抑郁剂治疗中的改变目的:探讨MDD患者血清中tPA-BDNF通路主要因子的蛋白水平,包括tPA、BDNF、TrkB、pro BDNF、p75NTR和VGF较健康对照（healthy controls,HC）是否发生改变,并观察其在抗抑郁剂治疗后表达水平是否得到改善,以及分析其对MDD的诊疗价值。方法:采集35例MDD患者在抗抑郁剂（艾司西酞普兰或度洛西汀）治疗前和治疗8周后的血清样本,和35例HC的血清样本。采用酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测tPA-BDNF通路主要因子的血清蛋白浓度,包括tPA、BDNF和其受体TrkB以及pro BDNF和其受体p75NTR。此外在26例MDD患者抗抑郁剂（艾司西酞普兰或度洛西汀）治疗（8周）前后和25例HC的血清中采用ELISA检测了tPA-BDNF通路相关蛋白VGF的水平。MDD的严重程度采用17项汉密尔顿抑郁量表（17-item Hamilton depression rating scale,HDRS-17）进行评估。结果:与HC组相比,MDD组血清tPA和BDNF水平以及BDNF/pro BDNF比值显著降低（tPA:P=0.006,BDNF:P=0.001,BDNF/pro BDNF:P＜0.001）,而TrkB、pro BDNF及其受体p75NTR的水平则显著升高（TrkB:P=0.001;pro BDNF:P＜0.001;p75NTR:P＜0.001）。治疗8周后,与基线期相比,MDD组血清tPA和BDNF水平以及BDNF/pro BDNF比值显著升高（tPA:P=0.022;BDNF:P＜0.001;BDNF/pro BDNF:P＜0.001）,pro BDNF水平显著下降（P=0.015）,而p75NTR水平显著升高（P=0.041）,TrkB水平无显著改变（P=0.131）。MDD组血清VGF水平显著低于HC组（P=0.002）,且其在8周抗抑郁剂治疗后被逆转（P＜0.001）。tPA、BDNF、TrkB、pro BDNF和p75NTR均具有较好的诊断效能,受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve,ROC）下面积（area under the curve,AUC）＞80%或90%。这五个蛋白的联合显示出更好的诊断效能:AUC=97.7%、敏感性=88.1%、特异性=92.7%和准确性=90.6%。结论:tPA-BDNF裂解通路可能与MDD的发病以及抗抑郁剂治疗起效的潜在机制有关。血清VGF可能参与MDD的发病和抗抑郁剂起效。血清tPA、BDNF、TrkB、pro BDNF和p75NTR均呈现了较好的诊断价值且其联合可能对MDD的诊断具有一定的价值。二、外周血p11-tPA-BDNF通路因子m RNA水平在抑郁症和抗抑郁剂治疗中的改变目的:探讨外周血p11-tPA-BDNF通路主要因子的m RNA水平是否参与MDD的发生和抗抑郁剂的治疗。方法:采集了38例HC和41例MDD患者和17例随访的MDD患者抗抑郁剂治疗2周后的静脉血样本。采用实时定量PCR检测p11-tPA-BDNF通路主要因子的m RNA水平,包括p11、tPA、纤溶酶原激活物抑制剂-1（plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1）、BDNF、TrkB和p75NTR。MDD严重程度采用HDRS-17量表评估。结果:发现MDD组的BDNF和TrkB m RNA水平显著低于HC组（BDNF:P＜0.001,TrkB:P=0.040）,经过2周抗抑郁治疗后BDNF水平显著升高（P=0.038）,TrkB水平无显著改变（P=0.606）。与HC组相比,MDD组的p11和p75NTR m RNA水平显著升高（p11:P＜0.001,p75NTR:P=0.010）,且在药物治疗2周后显著降低（p11:P=0.043,p75NTR:P=0.007）。MDD组的tPA和PAI-1 m RNA水平与HC组相比无显著差异（tPA:P=0.346,PAI-1:P=0.438）,且在抗抑郁治疗后无显著改变（tPA:P=0.918,PAI-1:P=0.112）。未发现基线和药物治疗2周后p11-tPA-BDNF通路因子m RNA水平与MDD患者的抑郁症状严重程度之间呈显著相关性（P＞0.05）。将在MDD组和HC组之间有显著差异的四个因子进行了单独和联合ROC分析,显示p11、BDNF、TrkB和p75NTR均呈现了较好的诊断价值,其AUC分别为86.4%、87.1%、79.7%和83.5%。这四种因子的联合显示出可为MDD诊断提供更好的诊断能力:95.9%的AUC、87.8%的敏感性、89.3%的特异性和88.0%的准确性。结论:外周血p11-tPA-BDNF通路主要因子的m RNA水平可能与MDD的发病机制以及抗抑郁剂起效的潜在机制有关。p11、BDNF、TrkB和p75NTR均呈现了较好的诊断价值且其联合可能对MDD的诊断具有一定的价值。第二部分p11-tPA-BDNF通路机制初步研究目的:探讨p11是否通过调控tPA-BDNF通路参与抑郁,以及BDNF受体TrkB的小分子激动剂7,8-二羟基黄酮（7,8-dihydroxyflavone,7,8-DHF）和N-[2-（5-羟基-1H-吲哚-3-基）乙基]-2-氧哌啶-3-羧酰胺（N-[2-（5-hydroxy-1H-indol-3-yl）ethyl]-2-oxopiperidine-3-carboxamide,HIOC）是否可以改善p11基因敲除（gene knockout,KO）小鼠的抑郁样行为。方法:提取成年p11 KO小鼠（C57BL/6）和匹配的野生型（wild type,WT）小鼠的海马和前额叶皮层（prefrontal cortex,PFC）脑区,并通过western blot的方法检测tPA-BDNF通路相关蛋白以及突触相关蛋白的表达。通过腹腔注射BDNF受体TrkB的小分子激动剂7,8-DHF和HIOC,观察其能否改变p11 KO小鼠的抑郁样行为。结果:发现在海马中,与WT小鼠相比,p11 KO小鼠BDNF、TrkB和PSD95水平显著下降（P＜0.05）,而p-TrkB、pro BDNF、p75NTR、胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases,ERK）、p-ERK、蛋白激酶B（protein kinase B,Akt）、p-Akt、CREB、p-CREB、Synapsin 1等均无显著差异（P＞0.05）。在PFC中,与WT小鼠相比,p11 KO小鼠pro BDNF水平显著升高（P=0.002）,而p75NTR、BDNF、TrkB、p-TrkB、Akt、p-Akt、CREB和p-CREB的水平无显著改变（P＞0.05）。发现7,8-DHF 1 mg/kg、5 mg/kg、10 mg/kg在被动回避实验（passive avoidance test,PAT）中均未显著改变WT小鼠进入暗室的潜伏时间（P＞0.05）。7,8-DHF 5 mg/kg也未显著改变WT小鼠在强迫游泳实验（forced swimming test,FST）中的不动时间（P=0.267）。MK-801可以显著降低WT小鼠在PAT实验中进入暗室的潜伏时间（P=0.012）,而7,8-DHF 5mg/kg未能显著逆转这种改变（P=0.705）。与WT小鼠相比,p11 KO小鼠在PAT实验中进入暗室的潜伏时间显著下降（Pgenotype=0.008）,在FST实验中的不动时间显著增加（Pgenotype=0.028）。HIOC在PAT和FST实验中未显著改变WT小鼠和p11 KO小鼠进入暗室的潜伏时间和不动时间（P＞0.05）。结论:p11可能通过下调海马BDNF-TrkB通路信号转导和上调PFC脑区pro BDNF相关通路,进而调节神经可塑性。TrkB受体激动剂7,8-DHF和HIOC未能显著改变WT小鼠和p11 KO小鼠的抑郁样行为。