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流行性出血热是由汉坦病毒感染引起的一种急性传染病,临床上表现为发热、休克、出血、急性肾功能衰竭等症状。自1978年李镐汪等从疫区的黑线姬鼠肺组织中分离到汉坦病毒76-118株以来,各国学者相继分离到不同型别的汉坦病毒。目前汉坦病毒已鉴定出多种型别:姬鼠型(Hantaan HTN),家鼠型(SeoulSEO),(Puumala PUU),(Sin Nombre SNN),(Dobrave DOB)等,在我国主要流行HTN和SEO 2种型别。我国每年发病人数4-7万,是世界上出血热的高发区,目前缺乏特异的治疗方法,因此,对流行性出血热的早期诊断和及时防治非常重要。汉坦病毒是分节段的负链RNA病毒,是布尼亚病毒科中一个独立的属,该病毒的基因由大L(6530-6550核苷酸),中M(3613-3707核苷酸),S(1696-2083核苷酸)三个RNA片段组成,这三个片段分别编码:依赖RNA的RNA聚合酶,糖蛋白G1和G2,核蛋白。其中核蛋白在不同型别之间具有较高的同源性,可以诱导体液免疫应答与细胞免疫应答。研究表明,其中核衣壳蛋白具有很强的抗原性和免疫原性,是早期诊断的最佳抗原。本文旨在探讨NP的抗原性,选择S片段的最佳抗原位点体外构建并表达NP,并将表达好的NP用于荧光定量PCR(RT-PCR),免疫滴金法(CGIDA),酶联免疫吸附法(ELISA),对病人血清进行早期诊断。对临床及流行病学及早、准确地诊断、治疗汉坦病毒引起的流行性出血热至关重要。一.汉坦病毒RT-PCR检测试剂标准品的构建及其在早期诊断中的应用研究为了对汉坦病毒进行早期的定性检测,同时对核衣壳蛋白(NP)的抗原性和免疫原性进行进一步的探讨,我们采用76-118株的S片段构建荧光定量PCR(RT-PCR)标准品,并建立以特异性荧光探针为特点的TaqMan荧光定量PCR方法用于早期检测汉坦病毒核酸。首先对76-118株的S片段基因进行序列分析,利用引物设计软件设计出一对引物和一条荧光探针,对病毒RNA进行抽提,逆转录为cDNA,经PCR扩增,产物纯化后与PMD 18-T Vector连接,转化到大肠杆菌DH5α,筛选得到标准品的质粒,提取质粒并进行定量。在S片段的保守区设计引物和TaqMan探针,对real-time PCR条件进行优化,并提取急性期发病病人总RNA,逆转录为cDNA,与标准品同时进行荧光定量PCR检测。同时用免疫荧光法(IFA)检测这些急性期病人的抗体滴度。实验结果表明:该方法制备的质粒标准品经荧光定量PCR扩增证实构建成功,应用于汉坦病毒早期检测,能对检测样品进行质量控制;应用荧光定量PCR同时对急性期病人和标准品进行病毒含量检测,保证了实验过程的一致性,具有高度特异性和灵敏度,从病毒核酸提取至检测完成仅需3h左右,重复性好,并能在定性检测的基础上对病毒准确定量。实验表明本研究建立的汉坦病毒荧光定量标准品和TaqMan荧光定量PCR方法特异、敏感、快速,适用于汉坦病毒的早期检测;同时进一步证明了汉坦病毒S片段编码的核衣壳蛋白(NP)是流行性出血热早期诊断的理想抗原。二.汉坦病毒S片段编码蛋白原核表达载体的构建及重组蛋白的表达和纯化为了制备特异性强,灵敏度高的理想抗原,我们分段构建汉坦病毒76-118株核蛋白S基因核心区域原核表达质粒。首先从HTNV 76-118株感染的Vero-E6细胞中提取总RNA作为模板,根据NCBI提供的76-118国际标准序列设计引物,分3段进行目的基因PCR反应,经酶切、连接、转化、构建了HTN型汉坦病毒S片段的核心区域表达载体pGEX-4T-1-S1、pGEX-4T-1-S2、pGEX-4T-1-S3,并对重组产物进行测序。结果显示:重组产物的序列完全正确。我们对构建的载体进行原核表达,首先进行少量表达,并用蛋白质电泳和考马斯亮蓝染色,根据SDS-PAGE的结果显示,只有N端(34bp-340bp)克隆片段长度为334碱基,167氨基酸的表达载体pGEX-4T-1-S1在IPTG诱导下可表达。重组表达的蛋白存在于菌体包涵体中,重组表达的蛋白为167AA,约12KD,GST的蛋白分子量为26KD,重组的融合蛋白总分子量为38KD。经大量表达后用Western-blot将重组蛋白与单克隆抗体和HFRS患者的高效价血清进行免疫印迹反应。在沉淀蛋白泳带相对分子质量38KD的位置,明显可见一条蛋白条带,与预计相对分子质量相符,故可初步确定其为插入基因的表达产物,成功构建了重组核蛋白原核表达载体pGEX-4T-1-S1,获得高纯度的抗原。三.汉坦病毒重组核衣壳蛋白在流行性出血热早期诊断中的应用流行性出血热是由汉坦病毒引起的人类急性传染病,自HV成功分离以来,对该病的血清学特异性诊断方法迅速建立,酶联免疫吸附实验(ELISA)用于检测病毒特异性的IgM和IgG抗体,用间接免疫荧光法(IFA)检测HFRS患者血清特异性IgG和IgM抗体,以上两种方法是目前国内实验室常用的方法,在急性感染中,特异性IgM的检测以及双份血清IgG效价增高4倍以上有利于诊断。免疫滴金法(CGIDA)曾成功地用于多种传染病的检测,具有操作简便,快速,及特异性高等特点。为了建立及推广合适基层单位使用的特异、敏感、快速、简便、稳定的早期分型诊断和监测方法,探索应用重组汉坦病毒核蛋白(rNP)的免疫滴金法(CGIDA)对流行性出血热的早期诊断价值。本研究采用纯化的汉坦病毒核蛋白抗原,制备成CGIDA检测试剂盒。在相同的CGIDA系统中,同时检测流行性出血热急性期病人血清,比较研究rNP与天然汉坦病毒蛋白(NP)的抗原功能。并与酶联免疫吸附试验(ELISA)和间接免疫荧光法(IFA)对比检测。实验证明,用rNP与天然NP平行检测HFRS IgM符合率达89.7%,HFRS IgG符合率达92.3%;CGIDA法检测HFRSIgM的敏感性为75.0%,特异性为100%;CGIDA法检测HFRS IgG的敏感性为83.1%,特异性为100%;证实了该重组核蛋白的CGIDA对HFRS的早期诊断具有较好的应用价值。