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苹果轮纹病是苹果生产中最重要的病害之一,可危害苹果的枝干和果实,给苹果产业造成巨大损失,据统计,中国苹果产区每年因苹果轮纹病造成的损失高达50亿元。WRKY转录因子参与植物的各种生理过程,其中一个主要功能与植物的抗病有关,在植物的抗病反应调控网络中起着关键作用。而到目前为止,虽然WRKY转录因子在拟南芥、烟草等模式植物中已有较深入研究,但对于调控苹果对轮纹病抗性的苹果基因组WRKY转录因子的筛选与鉴定,国内外仍研究报道较少,因此,本研究以转基因苹果愈伤组织和拟南芥为材料,并利用原生质体转化、接菌等技术,鉴定MdWRKY40基因的生物学功能,来阐明MdWRKY40基因在苹果抵御轮纹病菌侵染过程中的作用,为进一步揭示苹果的抗病机制以及培育抗病新品种提供理论依据。主要研究结果如下:1.以‘红富士’苹果果实为试材,克隆得到MdWRKY40基因的全长CDS序列,系统进化树分析表明,苹果MdWRKY40与白梨PbWRKY40序列相似性最高,亲缘关系最近,蛋白序列比对分析发现,MdWRKY40蛋白与拟南芥AtWRKY4、AtWRKY40蛋白都包含5个β折叠,都含有一个C2H2锌指结构和一个WRKYGQK保守结构域,并且该保守结构域横跨整个β2折叠。2.分段克隆得到MdWRKY40的启动子序列,转化苹果原生质体并用SA处理,进行荧光素酶活性分析,发现该启动子序列特异性响应SA,并且不同长度的启动子序列对SA响应能力不同,当核酸序列增加到2000 bp时,对SA的响应能力最强,为未经SA处理的11.5倍,但对SA进行响应的具体顺式作用元件需进一步探究。3.在‘嘎拉’组培苗的根、茎、叶中,0.5 mM的SA强烈诱导了MdWRKY40基因的表达,且均呈现先升高后降低的趋势,在6 h时表达量最高。外源SA处理可以提高苹果叶片对轮纹病菌的抗性,发病率由92.59%降到了79.26%,病程相关蛋白基因MdPR2、MdPR5的表达量显著高于对照。4.超表达MdWRKY40基因苹果愈伤组织接种轮纹病菌3 d后发现病斑扩展面积显著低于对照,由26.44cm2降到了8.68cm2,病程相关蛋白基因MdPR2、MdPR5、MdPR8的表达量显著高于普通‘王林’愈伤组织,提高了苹果愈伤组织对轮纹病菌的抗性。沉默苹果愈伤组织中的MdWRKY40基因后发现病斑扩展面积无显著变化,对苹果轮纹病菌的抗性无显著影响,但降低了病程相关蛋白基因MdPR2、MdPR4、MdPR5、MdPR8的表达量。5.异源表达MdWRKY40基因的拟南芥叶片接种苹果轮纹病菌后,与对照相比,发病率低,发病症状轻,野生型拟南芥发病率达到了77.5%,而两个转基因株系发病率只有21.5%和17.4%,病程相关蛋白基因AtPR1、AtPR3、AtPR4的表达量升高,提高了拟南芥对苹果轮纹病菌的抗性。6.在拟南芥中异源表达MdWRKY40后显著抑制了拟南芥主根的伸长,培养7 d后两个转基因株系主根长度分别是野生型拟南芥的39.9%和43.1%,培养10 d后主根长度分别是野生型拟南芥的58.5%和55.4%,生长素合成相关基因AtTAA1及生长素运输相关基因AtPIN1、AtPIN2的表达量显著降低。7.利用MdMPK6过表达苹果愈伤组织,并诱导纯化MdWRKY40蛋白,Pull down试验结果表明MdWRKY40蛋白与MdMPK6蛋白互作。