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聚合酶链式反应(PCR)是现代分子生物学核心技术之一,它能够在体外扩增DNA,并能使微量的模板在数小时内以指数形式扩增数百万倍。但在实际运用中,PCR技术还存在一定的限制,如复杂背景下的非特异性产物、扩增效率等问题。随着纳米技术的发展,纳米技术和生物技术的融合引起了人们的关注,为解决生物技术难题提供了契机。石墨烯具有高比表面积、良好的热传导性和生物相容性,在生物医学领域已经得到了广泛的应用。本论文研究了石墨烯对PCR反应的影响,并探讨其影响机制。主要研究结果如下:
1.石墨烯的制备:以天然石墨为原料,采用改进的Hummers法制备了氧化石墨烯;以水合肼为还原剂,在氨水中制备了水溶性良好的还原石墨烯。所得石墨烯片尺寸大小为200nm～2μm;还原石墨烯表面羧基含量约为5.29％,羟基含量约为2.55％,氨基含量约为7.2％;
2.石墨烯增强PCR反应特异性的研究:以pET032a质粒DNA和基因组DNA为模板进行多轮PCR扩增,基于还原石墨烯的PCR反应能进行8轮和3轮,还原石墨烯的最优浓度分别为12μg/mL和10μg/mL;基于氧化石墨烯的PCR扩增仅能进行2轮,且第2轮扩增产物的特异性较低。还原石墨烯还能拓宽PCR的退火温度范围,使PCR反应低至25℃时依然能够退火,得到单一的目的产物;对PCR扩增产物进行序列测定,结果显示石墨烯参与的PCR反应产物的序列与标准序列没有差异;
3.石墨烯增强PCR反应特异性机制的研究:测定石墨烯与PCR各组分的Zeta电位,还原石墨烯-pfuDNA聚合酶的Zeta电位为5.39 mV,因此带正电的还原石墨烯-PfuDNA聚合酶复合物利于吸附带负电的引物和模板到石墨烯表面,从而减少非特异性产物,提高PCR反应的特异性;向被还原石墨烯抑制的PCR体系中加入牛血清白蛋白(BSA),当其浓度高于5μg/mL时,可解除高浓度还原石墨烯的抑制,表明PfuDNA聚合酶吸附在石墨烯表面;UV-Vis、圆二色光谱表明石墨烯与PfuDNA聚合酶发生强烈的相互作用。因此石墨烯与DNA聚合酶、DNA模板间的相互作用以及石墨烯良好的导热性是增强PCR反应特异性的主要原因。