白内障严重影响人类健康,是最常见的致盲原因之一。其中绝大部分是随年龄增长所引起的老年性白内障。目前国内外治疗老年性白内障的方法仍集中于手术治疗,缺乏有效的预防及早期治疗药物。因此,深入研究晶状体浑浊的发生、发展机制,筛选有效的抗晶状体浑浊药物,尤其提倡从早期预防着手、尽力降低低龄患者的二次手术率,不仅能减轻患者痛苦,而且具有重要的社会、经济效益。哺乳动物晶状体中的晶体蛋白,主要分为α、b、g三大类。此前,文献研究大都集中在α族晶体蛋白类的研究,挖掘其“伴侣蛋白”对抗晶状体浑浊的作用。但是,进一步研究发现,βB2晶体蛋白的结构和功能均十分特殊,且在哺乳动物晶状体中该蛋白成分含量最高,故其结构及水溶性成分的水平对于维持晶状体的透明性和折射率至关重要。如能适度调控其表达,有望成为延缓晶状体浑浊进程的有效手段。因此,βB2晶体蛋白更加适合作为年龄相关性晶状体功能研究的靶蛋白。为此,探寻可调控βB2晶体蛋白表达的上游micro RNA,并明确其调控机制,从而实现调控βB2晶体蛋白在晶状体中的表达量,进而延缓晶状体浑浊的进程。Micro RNAs是一类非编码单链小分子RNA,在胚胎发育、分化,细胞增殖、凋亡、代谢和适应环境压力等进程的转录过程中起重要作用。研究表明miRNAs在眼部组织,包括角膜、脉络膜小疣、视网膜、玻璃体、晶状体和中均有特异性表达,并可能通过调控晶体蛋白的表达,参与晶状体混浊的发生、发展过程。因此,探究特异性调控βB2晶体蛋白表达的miRNA,对老年性白内障的早期预防和治疗具有重要价值。本文探讨miR-326在人晶状体上皮细胞HLEC-B3中的功能及其调控Crybb2可能的分子机制,并验证了miR-326在硒性白内障模型大鼠晶状体中的治疗作用,为老年性白内障的早期预防和治疗提供了新途径。我们首先通过数据库的筛查和文献阅读,筛选出miR-326、miR-204-5p、miR-491-5p、miR-330-5p四个与βB2基因相关的miRNA。之后采用实时荧光定量PCR验证了miR-326、miR-204-5p在βB2基因敲除(KO)小鼠晶状体中的表达量与C57BL/6野生型(WT)小鼠相比明显下调。其中,miR-326的表达差异最显著,提示晶状体中miR-326水平可能与Crybb2的表达有某种相关。随后,我们在人晶状体上皮细胞HLEC-B3中,用双荧光素酶报告基因实验证实miR-326的下游靶基因为FGF1。进一步实验证实:在晶状体上皮细胞中抑制miR-326的表达可促使FGF1的表达量增加,进而上调Crybb2的表达量,最终有助于抗晶状体混浊的发生、发展。由此,初步阐明了在细胞中miR-326调控Crybb2的作用机制。此外,通过硒性白内障模型大鼠晶状体中的研究也支持上述结论。综上所述,本实验探寻出一条可以通过抑制晶状体内miR-326的表达,促使FGF1的表达、增加晶状体内βB2晶体蛋白表达量,从而有效延缓老年性白内障的新途径;并以此为基础申报了国家发明专利;拟开发以miR-326为中心的新型抗晶状体浑浊药物,为老年性白内障的“未病先防”提供理论及实验依据。第一部分WT与Crybb2-/-小鼠晶状体中miRNA的筛查目的:筛查与βB2具有靶向联系,且在WT与Crybb2-/-小鼠晶状体中表达差异较大的miRNA。方法:通过小鼠基因鉴定技术,鉴定WT、Crybb2-/-小鼠;通过Pic Tar、Sanger miRBase及Target Scan algorithms数据库及通路分析筛选出与βB2基因之间存在靶向性关系的miRNA;采用q RT-PCR验证上述候选靶基因在WT、Crybb2-/-小鼠晶状体中的表达差异。结果:(1)挑选出四个与βB2之间存在靶向性关系的miRNA:miRNA-326、miR-204-5p、miR-330-5p、miR-491-5p;(2)通过q RT-PCR筛查发现miR-326、miR-204-5p在WT、Crybb2-/-小鼠晶状体中表达差异显著,尤其是miR-326的表达差异更为明显。结论:miR-326可能通过某种途径调控βB2晶体蛋白的表达。】第二部分MiR-326在晶状体上皮细胞(HLEC-B3)中调控Crybb2表达的机制探究目的:探讨miR-326通过何种通路影响下游基因、调控Crybb2表达。方法:(1)采取双荧光素酶报告基因实验,明确miR-326的下游靶基因;在HLEC-B3细胞分别转染miR-326 agomir(模拟物)和antagomir(抑制体)72h后,采用western blot、免疫荧光技术检测下游靶基因及Crybb2的表达情况;(2)在HLEC-B3细胞中分别转染FGF1因子及sh FGF1,48h后采用western blot检测Crybb2的表达变化;(3)在HLEC-B3细胞中分别转染FGF1因子及sh FGF1,2h后两组分别转染miR-326 antagomir,培养72h后采用western blot分别比较上述FGF1因子组及sh FGF1组与阴性对照组中Crybb2表达的变化;(4)在HLEC-B3细胞中分别转染miR-326 agomir和antagomir 48h后,采用200μM H2O2处理HLEC-B3细胞24h,诱导细胞凋亡,采用流式细胞仪观察细胞凋亡率。结果:(1)实验证实miR-326的下游靶基因为FGF1;(2)FGF1可以有效调控晶状体上皮细胞中Crybb2的表达;(3)证实在HLEC-B3中抑制miR-326表达后FGF1的表达量上调,最终使Crybb2高表达;反之,在HLEC-B3中增加miR-326的表达量后,FGF1的表达量下调,最终降低Crybb2的表达;(4)在HLEC-B3中下调miR-326的表达量使FGF1表达上调,可以抑制晶状体上皮细胞的凋亡。结论:(1)miR-326通过与靶基因FGF1的3′-UTR结合而特异性抑制FGF1的表达,从而抑制Crybb2的表达;(2)在晶状体上皮细胞中抑制miR-326的表达可以抑制其凋亡,进而与晶状体浑浊的发生、发展相关。第三部分MiR-326在硒性白内障模型大鼠晶状体内调控Crybb2表达并延缓白内障进展的探究目的:探讨miR-326在硒性白内障模型鼠晶状体内调控Crybb2表达并延缓白内障进展的作用。方法:9天龄SD大鼠皮下注射亚硒酸钠溶液(25μmol/kg),构建亚硒酸钠白内障模型鼠;左眼为阴性对照,滴加miR-326 antagomir(抑制体)的阴性对照,右眼为治疗眼,滴加miR-326抑制剂antagomir(抑制体),阴性对照与治疗眼,每天早晚两次滴药,每次100μl,每天每只眼球共用药1nmol,观察白内障浑浊进展;采用q RT-PCR检测晶状体内药物作用情况,并采用western blot技术检测晶状体内FGF1、Crybb2的表达变化。结果:(1)硒性白内障模型鼠眼滴miR-326 antagomir(抑制体)后,其晶状体内miR-326表达量下降,FGF1及Crybb2表达量升高。(2)滴加miR-326 antagomir(抑制体)的治疗眼与阴性对照眼相比白内障进程显著减缓。结论:实验证实在硒性白内障模型鼠晶状体内,通过miR-326的抑制剂antagomir靶向上调FGF1的表达,进而促进晶状体内Crybb2的表达,可以在一定程度上延缓白内障的进展。