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乳酸菌是人类胃肠道的常见菌群。大多数乳酸菌,特别是乳酸杆菌,因其在发酵食品和益生菌方面的中的应用而闻名。因此,对于乳酸杆菌的生理特性、功能蛋白等分子生物学的研究成为乳酸菌研究工作中的前沿。除了乳杆菌自身的生理特性研究外,一些公认的益生菌菌株被认为在治疗人类胃肠疾病中起到积极作用,有报道乳酸菌和宿主的免疫系统相关研究报道,但人们对于乳酸菌在胃肠道内如何发挥益生作用的机理尚不清楚。诚然,有效的对乳酸菌进行分子标记,将使得直观研究乳酸菌的功能因子及其作用机制成为可能,同时开发并利用标记的示踪技术,也将有效监测胃肠道内乳酸菌的活动过程,使得乳酸菌在胃肠道中的生存机制、乳酸菌与病原体之间的相互作用过程等机制研究更加直观。本文分别建立了质粒型和整合型mcherry基因荧光标记乳酸菌的方法,该研究为进一步开展乳酸菌的分子生物学研究奠定基础。本文选用植物乳杆菌WCFS1为研究对象,该菌株基因组已完成测序,是测序较早、生物学信息较全、蛋白基因等分子标识标注较多的乳杆菌菌株。此外,目前已有很多文献报道外源蛋白在WCFS1中的成功表达。因此,对植物乳杆菌WCFS1成功进行荧光标记,也为更多乳酸菌的分子标记研究提供理论依据。首先,本文选取GFP和mCherry两种荧光蛋白标记对植物乳杆菌WCFS1进行标记。分别在乳杆菌表达质粒pSIP中插入GFP和mCherry编码基因,考察不同荧光标记基因在植物乳杆菌WCFS1中的表达情况。实验结果显示虽然gfp和mcherry基因均能成功重组表达(Western Bloting检测到重组蛋白条带),但是在GFP绿色荧光蛋白检测条件下对照组菌株荧光背景高,实验组菌株YGW460绿色荧光不明显。反之,在mCherry红色荧光蛋白检测条件下对照组菌株荧光背景很低,实验组菌株YMW460红色荧光较亮,该菌株诱导表达16h后,荧光活性达到最高值35218RFU。该结果确定了本研究将采用mcherry基因对植物乳杆菌WCFS1进行荧光标记。其次,为了实现mcherry基因在植物乳杆菌WCFS1中的持续型表达,本文选用了 3种不同持续型表达启动子即PldhL、PslpA和P32开展了 mcherry基因表达的研究。研究结果显示3种启动子均可以实现mcherry基因持续型表达。其中,在启动子PidhL操作下mcherry基因表达的荧光活性最佳,重组菌YMPldhLW460H培养14h后,荧光值达到34569RFU。该结果为mcherry基因在植物乳杆菌WCFS1染色体上的整合型表达提供有利条件。最后,本研究利用同源重组策略将PldhL启动子操纵下的mcherry基因整合至植物乳杆菌WCFS1染色体上,随后,利用Cre-lox-Based system将同源重组过程中的抗性筛选标记移除,成功构建了 mcherry整合型植物乳杆菌WCFS1突变菌株YMW5328,该菌株培养18h后,荧光值达到22346RFU。该菌株的最大荧光强度虽然相比质粒型荧光标记菌株YMPldhLW460H荧光值较低,但是由于荧光基因整合在染色体上,菌株荧光活性表达稳定,传代不易丢失,相信在日后的乳酸菌研究中则更具有优势。综上所述,本研究系统研究了mcherry基因荧光标记植物乳杆菌WCFS1的方法,先后建立了质粒型和整合型mCherry荧光蛋白标记植物乳杆菌WCFS1的最佳方案,为进一步开展乳酸菌的生理特性及发挥肠道益生性能的分子机制的研究提供有效手段。