论文部分内容阅读
果实耐贮性是体现其品质的最主要性状之一,然而利用传统的生理生化方法对果实保鲜效果甚微。随着分子生物学技术的快速发展,从基因层面开展调控果实成熟衰老已成为将来研究的必然途径。从乙烯合成途径调控果实的成熟,其效果仅局限于呼吸跃变型果实,因此从比乙烯调控更上游的转录因子调控才能从根本上达到调控果实成熟衰老进程的目的。草莓是世界上栽培面积仅次于葡萄的浆果,而且人们对草莓的需求量总是供不应求。和多年生木本果树不同,草莓为草本宿根果树,种植周期为果树中最短的,并可周年生产,用作实验材料最为合适。作为典型的非呼吸跃变型果树,研究基因对其果实的成熟调控具有重要的意义。本文结合MADS-box这个多基因家族的研究模式,对草莓MADS-box基因进行了初步探索,从草莓绿果中分离了33条保守的MADS-box基因cDNA片段,并从果实中克隆了FaMADSl和FaMADS2基因,对这两个基因在草莓果实各个时期的表达特性进行了初步研究,以期利用这些基因进行草莓或其他非呼吸跃变型果树的果实成熟调控或为耐贮性改良提供理论依据。具体研究结果如下：1.作为调控花发育和果实发育成熟的重要转录因子,MADS-box基因家族已经在多种植物中克隆获得。为了从草莓果实中克隆出与果实成熟相关的基因,根据NCBI里多种植物的MADS-box基因保守序列设计简并引物,以绿果期草莓为试材,应用RT-PCR技术分离出MADS-box基因cDNA片段。序列分析表明,这些片段长度在137～146bp之间,包含基因起始密码子。推导的氨基酸序列与已登录的草莓的MADS-box基因序列同源性超过87%。推导的氨基酸序列与已知的草莓和其他物种调控果实发育成熟的MADS-box基因序列以及拟南芥的MADS-box家族基因序列进行系统发育分析,可将这些基因片段分别归入拟南芥MADS-box基因不同亚家族中,证明草莓果实中存在各类MADS-box家族基因,克隆的部分片段可能参与调控果实发育和成熟软化的调节。2.为了探明栽培草莓中与果实成熟相关的MADS-box基因,根据NCBI里公布的野生草莓(Fragaria virginiana) MADS-box基因Fv-MADS-9序列,设计特异引物,通过PCR技术,从栽培种凤梨草莓(Fragaria ananassa)中克隆出该基因的保守片段,再通过RACE-PCR的方法获得该基因全长。该基因的GenBank登录号为HQ602763,共1167bp,命名为FaMADS1。其中5’非编码区为100bp,3’非编码区为320bp, Ploy(A)尾巴为30bp,开放阅读框为747bp,编码249个氨基酸。推导氨基酸分子量为28.7KDa,pI为8.51。FaMADS1的预测氨基酸序列与不同植物的已知MADS-box蛋白进行同源性比较表明FaMADS1与草莓Fv-MADS-9基因具有98%的同源性。序列分析表明,FaMADS1也存在一些在所有MADS-box蛋白间高度保守的区域,如MADS结构域和K结域。3.在3’RACE过程中克隆得到草莓的另一个MADS-box基因,GenBank登录号为HQ602764,命名为FaMADS2,共870bp。氨基酸同源性分析发现,该基因与来自智利草莓(Fragaria chiloensis)的FcMADS-2同源性较高。序列分析表明,FaMADS2基因3’非编码区为254bp, Ploy(A)尾巴为27bp,不完整的开放阅读框为540bp,编码180个氨基酸。FaMADS2的预测氨基酸序列与不同植物的已知MADS-box基因蛋白进行同源性比较表明FaMADS2分别与智利草莓FcMADS-1和FcMADS-2基因具有97%和96%的同源性。序列分析表明,FaMADS2也存在在所有MADS-box基因蛋白间高度保守的K结域。4.采用半定量RT-PCR技术,分别分析了FaMADS1、FaMADS2基因在花器官和果实发育的七个不同时期的草莓果实中的表达差异,结果表明,FaMADS1基因在草莓的花器官中不表达,为果实特异性表达基因。不同成熟度FaMADS1基因表达量分析表明,绿色期和白色期表达量较低,转红时表达最高,全红时有所下降。FaMADS1基因随着草莓成熟表达量逐渐增加,衰老期又开始降低,FaMADS1基因表达量与果实成熟进程相关。FaMADS2基因在草莓的花器官中表达量最高,在果实成熟各个阶段也均有表达。不同成熟度FaMADS2基因表达量分析表明,绿果期表达量最低,成花和白果期表达量较高,转红后又有所下降。FaMADS2基因随着草莓成熟表达量逐渐降低,转白后升高,转红后又降低。FaMADS2基因表达量与果实成熟进程相关。