细胞的免疫应答可分为先天性免疫应答和获得性免疫应答，先天性免疫应答是机体抗感染免疫的第一道防线，在获得性免疫活化前，它就开始发挥抗感染的作用。先天性免疫应答途径的激活主要是通过模式识别受体(Pattern RecognitionReceptors，PRRs)识别病原相关分子模式（Pathogen-Associated Molecular Patterns，PAMPs）。PRRs根据其结构特点主要包括:NOD样受体(NOD-like receptors，NLRs)、Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)和RIG-Ⅰ样受体(RIG-Ⅰ-liker receptors，RLRs)等。PAMPs主要包括细菌的细胞壁组分、鞭毛蛋白、脂多糖、非甲基化CpGs、病毒的遗传物质和细胞自身产生的损伤分子等。PRRs识别PAMP后，发生构象改变并募集下游的接头蛋白，激活下游的一系列激酶，启动细胞内级联反应，进而激活转录因子NF-κB(Nuclear FactorκB)和干扰素调控因子(InterferonRegulatory Fac(e)rs，IREs)，最终激活宿主的免疫反应。转录因子NF-κB、IRF3及AP-1(Activator protein1)调控Ⅰ型干扰素的表达在抗病毒先天性免疫途径中起到了极为重要的作用，然而，Ⅰ型干扰素信号通路的过度激活会导致组织、器官损伤。因此，精确调控Ⅰ型干扰素表达，也是宿主先天性免疫信号通路的主要研究热点。　　本实验室前期工作中发现雌激素相关受体α(Estrogen related receptorα，ERRα)可能参与宿主先天性免疫信号通路的调控。ERRα是第一个被发现的孤儿核受体，它是通过雌激素受体α（Estrogen receptor，ERα）的DBD结构域低严谨性杂交发现的。研究显示ERRα的功能主要通过其转录因子活性，在PGC1α或PGC1β共刺激因子的辅助下，调节能量代谢及线粒体氧化磷酸化。临床研究结果表明ERRα失调与肥胖、糖尿病及肿瘤等代谢性疾病密切相关。近期研究发现，ERRα通过增强线粒体功能促进ROS的产生，帮助宿主细胞清除胞内感染的李斯特单胞菌。过氧化物酶体增殖物活化受体(PPARγ)促进能量代谢，同时也有促炎作用;肝X受体(LXR)通过抑制IRF3活性，抑制IFNβ的表达。提示我们核受体可能参与调控宿主先天性免疫应答。但是，目前尚未发现ERRα与宿主先天性免疫应答信号转导途径之间的相关性报道。本研究发现:　　1.病毒感染促进细胞内ERRα的表达:以293T、HeLa、A549和MEF细胞为研究模型，利用VSV病毒感染，通过免疫印迹的方法，发现病毒感染后细胞内ERRα的表达以时间依赖的方式显著增强;以DNA病毒HSV感染293T，通过免疫印迹的方法，发现病毒感染后细胞内ERRα的表达以时间依赖的方式显著增强。以上结果说明ERRα参与病毒感染过程。　　2.ERRα抑制先天性免疫应答信号通路的激活:通过IFN-β荧光素酶报告基因实验，发现过表达ERRα可以抑制polyI∶C、视黄酸诱导基因1(Retinoicacid-inducible gene1，RIG-Ⅰ)、线粒体抗病毒蛋白(mitochondrial antiviral signalingprotein，MAVS)、TANK结合激酶1（TANK-binding kinase-1，TBK1）和IKKε激活的IFN-β报告基因活性;以ERRα的化学抑制剂XCT790处理293T细胞后，利用VSV感染，通过RT-PCR检测方法，发现XCT790增强了病毒诱导的IFN-β的激活并促进了干扰素下游IP10、ISG56基因的转录水平。以上结果说明，ERRα抑制Ⅰ型干扰素信号通路的激活。　　3.ERRα通过抑制TBK1-IRF3复合物的形成抑制Ⅰ型干扰素信号通路的激活:在293T细胞中共转染ERRα和TBK1表达载体，通过免疫共沉淀和免疫印迹实验，发现外源ERRα和TBK1之间存在相互作用;构建GST-ERRα原核表达载体，通过GST-pull down实验，发现ERRα与TBK1之间存在体外相互作用;分离小鼠骨髓巨噬细胞，利用VSV病毒感染，通过免疫共沉淀和免疫印迹实验，发现ERRα和TBK1之间的相互作用随病毒感染时间的增加，先变强后逐渐降低;在293T细胞中共转染IRF3、TBK1和ERRα真核表达载体，通过免疫共沉淀和免疫印迹实验，发现ERRα可以显著降低IRF3与TBK1之间的相互作用;在293T细胞中过表达ERRα，利用VSV病毒感染，通过免疫印迹实验，发现ERRα过表达抑制病毒诱导的IRF3磷酸化水平;分离小鼠骨髓巨噬细胞，采用ERRα抑制剂XCT790或siRNA处理，利用VSV病毒感染，通过免疫印迹实验，发现病毒诱导的IRF3磷酸化水平在ERRα缺失细胞中显著增强。以上结果说明ERRα通过抑制TBK1-IRF3复合物的形成抑制Ⅰ型干扰素信号通路的激活。　　4.抑制ERRα的表达可以抑制病毒在细胞内的复制:在293T细胞中过表达ERRα，利用VSV病毒感染，通过免疫印迹及病毒滴度测定实验，发现过表达ERRα可以增加病毒VSV-G蛋白的表达及病毒的滴度;通过ERRα特异的抑制剂XCT790或siRNA抑制293T细胞内源ERRα表达，利用VSV病毒感染，通过免疫印迹及病毒滴度测定实验，发现ERRα表达缺陷可以减少病毒VSV-G蛋白的表达及病毒的滴度，同时细胞存活增加;通过ERRα特异的抑制剂XCT790或小干扰RNA抑制293T细胞内源ERRα表达，利用带有GFP标志的新城疫病毒NDV-GFP(Newcastle Disease Virus，NDV)，通过荧光显微镜方法，发现ERRα表达缺陷抑制NDV病毒在细胞中的复制。以上结果说明抑制ERRα的表达可以抑制病毒在细胞内的复制。　　5.动物实验证明ERRα基因在病毒感染过程中的作用:以ERRα敲除小鼠为研究模型，分离ERRα敲除小鼠骨髓细胞，诱导分化形成巨噬细胞，利用VSV病毒感染、polyI∶C或polydA∶T刺激，通过酶联免疫免疫吸附试验(Enzyme-LinkedImmuno Sorbent Assay，ELISA)，发现ERRα基因敲除巨噬细胞中，由病毒感染诱导的IFN-β表达和分泌水平显著增加;以ERRα基因敲除小鼠为研究模型，分离ERRα基因敲除小鼠骨髓细胞，诱导分化形成巨噬细胞，利用VSV病毒感染，通过RT-PCR实验，发现ERRα基因敲除巨噬细胞中，病毒诱导激活的IFN-β下游基因转录水平明显增高;以ERRα基因敲除小鼠为研究模型，利用小鼠尾静脉注射亚致死剂量的VSV病毒，分离感染小鼠肺组织，通过病毒滴度测定以及HE染色，发现ERRα基因敲除小鼠肺部的病毒载量显著降低、ERRα基因敲除小鼠肺组织的损伤减弱;以ERRα基因敲除小鼠为研究模型，利用小鼠尾静脉注射致死剂量的VSV病毒，发现ERRα基因敲除的生存率比野生型小鼠明显增加。以上结果提示我们ERRα可以作为潜在的抗病毒靶标。　　综上所述，本研究通过ERRα基因的过表达、特异性抑制剂以及RNA干扰等方法，发现ERRα是一个重要的Ⅰ型干扰素信号通路的负调控分子;通过免疫共沉淀、免疫印迹、GST-pull down等实验，进一步研究发现在病毒感染过程中，ERRα通过与TBK1竞争性结合，抑制了IRF3的活化，最终抑制了口N-β及其下游抗病毒效应因子基因的转录激活;通过基因敲除小鼠实验，发现ERRα基因敲除小鼠肺组织病毒载量减少、肺部损伤减弱、存活率增加。本研究不但发现了一个新的先天性免疫应答调控分子ERRα，而且揭示了其参与调控先天性免疫应答的分子机制，为开发新的抗感染药物提供可能靶标。